Enzymstabilisierung und Thermotoleranzfunktion der intrinsisch ungeordneten LEA2-Proteine ​​aus Dattelpalmen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11878 (2023) Diesen Artikel zitieren

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In Dattelpalmen sind die LEA2-Gene mit 62 Mitgliedern reichlich vorhanden, die fast alle allgegenwärtig sind. Ihre Funktionen und Wechselwirkungen mit potenziellen Zielmolekülen sind jedoch weitgehend unerforscht. In dieser Studie wurden fünf LEA2-Gene der Dattelpalme, PdLEA2.2, PdLEA2.3, PdLEA2.4, PdLEA2.6 und PdLEA2.7, kloniert und sequenziert, und drei davon, PdLEA2.2, PdLEA2.3 und PdLEA2 .4 wurden hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die Thermostabilität zweier unterschiedlicher Enzyme, Laktatdehydrogenase (LDH) und β-Glucosidase (bglG), in vitro funktionell charakterisiert. Insgesamt waren PdLEA2.3 und PdLEA2.4 mäßig hydrophil, PdLEA2.7 war leicht hydrophob und PdLEA2.2 und PdLEA2.6 waren keines von beidem. Sequenz- und Strukturvorhersagen deuteten auf das Vorhandensein eines Abschnitts hydrophober Reste in der Nähe des N-Terminus hin, der möglicherweise eine Transmembranhelix in PdLEA2.2, PdLEA2.4, PdLEA2.6 und PdLEA2.7 bilden könnte. Zusätzlich zur Transmembranhelix zeigte die Vorhersage der Sekundär- und Tertiärstrukturen das Vorhandensein einer ungeordneten Region, gefolgt von einer gestapelten β-Faltblattregion in allen PdLEA2-Proteinen. Darüber hinaus wurden drei gereinigte rekombinante PdLEA2-Proteine ​​in vitro hergestellt, und ihre Anwesenheit in der enzymatischen LDH-Reaktion steigerte die Aktivität und reduzierte die Aggregatbildung von LDH unter Hitzestress. In den bglG-Enzymtests zeigten PdLEA2-Proteine ​​außerdem ihre Fähigkeit, die bglG-Enzymaktivität zu bewahren und zu stabilisieren.

Pflanzen haben komplexe Regulierungsmechanismen entwickelt, um den Auswirkungen widriger klimatischer Bedingungen entgegenzuwirken. Die Mechanismen zur Verbesserung der abiotischen Stresstoleranz hängen größtenteils von Proteinmolekülen ab, die verschiedene pflanzenphysiologische Prozesse und Signalwege direkt steuern und steuern. Die Protein-Genfamilie der späten Embryogenese (LEA) ist eine Gruppe funktioneller Proteine, die Pflanzenzellschäden unter abiotischen Stressbedingungen schützen und reduzieren1. Diese Proteine ​​sind in ihrer Struktur ungeordnet und durch wiederholte Motive gekennzeichnet2. Basierend auf den konservierten Aminosäuresequenzmotiven wurden LEA-Proteine ​​in acht verschiedene Gruppen eingeteilt, wobei LEA2-Proteine ​​die vorherrschende Gruppe in Pflanzen darstellten. LEA2-Proteine ​​wurden vor allem in großen Mengen in reifen Samen von Gossypium hirsutum gefunden3 und wurden allgegenwärtig in blühenden und nicht blühenden Pflanzen exprimiert4. Sie reichern sich hauptsächlich in den späten Phasen der Samenentwicklung und in vegetativen Geweben an, um Pflanzen auf Umwelteinflüsse zu reagieren5. LEA2-Proteine ​​sind äußerst hydrophil und werden als intrinsisch ungeordnete Proteine ​​(IDPs) charakterisiert, die ihre Konformation als Reaktion auf Veränderungen in der umgebenden Mikroumgebung ändern können6. In der Unterfamilie der LEA2-Proteine ​​sind Dehydrine (DHNs) eine bekannte biochemische Gruppe, die hauptsächlich aus einem hohen Anteil geladener und polarer Aminosäuren und einem geringen Anteil hydrophober und unpolarer Reste besteht7.

LEA2-Proteine ​​sind umfassend an physiologischen Reaktionen von Pflanzen beteiligt, um die Toleranz gegenüber abiotischem Stress zu verbessern. Die Überexpression von Triticum aestivum L., TaLEA2-1 in Weizen steigerte deren Wurzelwachstum und Pflanzenhöhe und führte zu einer höheren Katalaseaktivität im Vergleich zu den Wildtyp-Sämlingen. TaLEA2-1 verlieh transgenen TaLEA2-1-Weizenpflanzen eine verbesserte Salztoleranz5. Darüber hinaus wurde in einer aktuellen Studie festgestellt, dass das LEA2-Gen PtrDHN-3 aus Populus trichocarpa eine wesentliche Rolle bei der Salz- und Trockenstresstoleranz spielt8. Es wurde beobachtet, dass die Überexpression von PtrDHN-3 die Salztoleranz transgener Hefen erhöhte und die Keimungsrate, das Frischgewicht und den Chlorophyllgehalt transgener Arabidopsis thaliana-Pflanzen unter Salzstress verbesserte8. Darüber hinaus zeigten die mit Baumwoll-LEA2-Genen transformierten Arabidopsis-Pflanzen im Vergleich zum Wildtyp ein höheres Wachstum unter Trockenstress9. Darüber hinaus wurde in Mais ein KS-Typ-DHN-Gen, ZmDHN13, isoliert und seine Überexpression in transgenen Tabakpflanzen erhöhte die Toleranz gegenüber oxidativem Stress10. In einer anderen Studie verbesserte die Überexpression des Prunus mume LEA2-Gens in transformiertem Tabak und Escherichia coli die Kältestresstoleranz11. Darüber hinaus führte die Überexpression von zwei A. thaliana-DREs, AtDREB1A oder AtDREB2A, zu einer Induktion von Kältestress-verknüpften Genen von LEA2-Proteinen, wie rd29A und COR4712. In den mutmaßlichen Promotoren der LEA2-Gene der Hochlandbaumwolle, G. hirsutum, wurden mehrere cis-Elemente gefunden, die mit abiotischem Stress in Zusammenhang stehen. Es umfasste MYBCORE-, ABRELATERD1-, ABRE-like-Sequenz- und ACGTATERD1-Elemente, von denen bekannt ist, dass sie eine funktionelle Rolle bei abiotischem Stress spielen13,14. Das Vorhandensein dieser stressfördernden Elemente unterstützt stark die Rolle der LEA2-Proteine ​​bei der Verbesserung der Toleranz gegenüber abiotischem Stress in Pflanzen, die in feindlichen Klimazonen wachsen.

In der Auferstehungspflanze Craterostigma plantagineum wurden mehrere LEA-mRNA-Transkripte und -Proteine ​​während eines Zyklus von Austrocknungsstress identifiziert15. Um Einblicke in die Phoenix dactylifera zu gewinnen, eine holzige extremophile Pflanze, die unter rauen Umweltbedingungen gedeiht, wurde ebenfalls eine RNA-Seq-Analyse durchgeführt, um den ABA-Signalweg der Dattelpalme als Reaktion auf Trockenstress zu verstehen16. Die Ohrmuschel der Dattelpalme wurde mit dem Hormon ABA behandelt, was zur Expression von 153 differentiell exprimierten Genen (DEGs) führte16. Unter den hervorgehobenen Genen wurde berichtet, dass LEA-Gene zusammen mit Phosphatasen aus der PP2C-Familie, ATP-Bindungskassettentransportern (ABC) und dem Schließzellen-Transkriptionsfaktor MYB74 hochreguliert sind. Darüber hinaus wurde eine Sequenzierung des gesamten Genoms der Dattelpalme durchgeführt und es wurde festgestellt, dass LEA2-Gene im Genom der Dattelpalme reichlich vorhanden sind17. Es wurde festgestellt, dass LEA2-Gene in Dattelpalmen aus zweiundsechzig Varianten bestanden17. Darüber hinaus wurde über eine hohe Expression von LEA2-Genen in Dattelpalmen berichtet, die mit Piriformospora indica unter Salzstress geimpft wurden18. Diese Ergebnisse sprechen für eine Beteiligung der LEA2-Gene an den abiotischen Stresstoleranzmechanismen der Dattelpalme.

Obwohl mehrere molekulare und physiologische Analysen stressbedingter Gene in P. dactylifera durchgeführt wurden, ist die funktionelle Charakterisierung der LEA2 (PdLEA2)-Gene von P. dactylifera immer noch unklar19. Es wird jedoch angenommen, dass LEA2-Proteine ​​hochflexible unstrukturierte Proteine ​​sind, die als Chaperone fungieren und mit mehreren Partnermolekülen wie Proteinen, Membranen, Nukleinsäuren und Metallionen interagieren können20. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurden die funktionellen Eigenschaften von LEA2-Proteinen erläutert, darunter ihre Rolle beim Schutz von Membranen, der Stabilisierung von Makromolekülen, der Unterstützung beim Abfangen freier Radikale und der Wirkung als Antioxidantien zur Linderung der oxidativen Schäden, die Pflanzen unter abiotischen Stressbedingungen zugefügt werden6. Ähnlich wie LEA2-Proteine ​​spielen die großen Hitzeschockproteine ​​(HSP) eine verwandte Rolle bei der Lösung des Problems der Fehlfaltung und Aggregation sowie ihre Rolle als Chaperone. Somit spielen LEA2-Proteine ​​eine entscheidende Rolle beim Schutz anderer Proteinmoleküle und Enzyme vor Aggregation und stabilisieren ihre Aktivitäten unter verschiedenen feindlichen Behandlungsbedingungen. Dennoch wurden nur wenige funktionelle Enzymtests entwickelt, um die schützende Rolle von LEA2-Proteinen auf Enzymaktivitäten zu untersuchen. Darüber hinaus wird beobachtet, dass die meisten industriellen Enzyme aufgrund der extremen Temperaturen bei den Verarbeitungsbedingungen, bei denen das Enzym konserviert werden muss, abgebaut werden.

Aufgrund der funktionellen Eigenschaften von LEA2-Proteinen können sie zur Stabilisierung und Erhaltung enzymatischer Aktivitäten vor Hitze bei industriellen Prozessen über einen längeren Zeitraum eingesetzt werden. In diesem Zusammenhang ist es notwendig, die Rolle von LEA2-Proteinen bei der Erhaltung der Thermosensitivität der Enzyme Laktatdehydrogenase (LDH) und β-Glucosidase (bglG) zu untersuchen. Das LDH-Enzym fungiert als Redox-Cofaktor, indem es das NADH/NAD+-Paar zur Katalyse der gegenseitigen Umwandlung von Pyruvat (Oxosäure) und Laktat (Alpha-Hydroxysäure) nutzt21. Es dient zur Umwandlung von pflanzlichem Pyruvat in Milchsäure unter anaeroben Bedingungen. Während bglG ein cellulolytisches Enzym ist, das beim Abbau von Cellulosebiomasse eingesetzt wird. Es ist an der Hydrolyse von Kohlenhydraten wie Stärke, Glykogen und ihren Disaccharidderivaten in ihre Monomere beteiligt22. Beide Enzyme werden in großem Umfang für industrielle und biotechnologische Anwendungen eingesetzt.

Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Rolle der LEA2-Proteine ​​von P. dactylifera auf die Thermotoleranz von Enzymen zu untersuchen und zu charakterisieren. Die vorliegende Studie betonte die Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den fünf PdLEA2-Proteinen im Hinblick auf ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften, Aminosäurebestandteile, Störungsneigung, erhaltenen Strukturmotive und sagte ihre Sekundär- und Tertiärstruktur voraus. Darüber hinaus wurden rekombinante PdLEA2-Proteine ​​hergestellt und ihre schützende Rolle auf die enzymatischen Aktivitäten und Stabilitäten von LDH und bglG unter Hitzestressbedingungen aufgeklärt. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie werden der erste Durchbruch bei der Identifizierung der Chaperon-Eigenschaft von LEA2-Proteinen der Dattelpalme bei der Protein-Enzym-Interaktion sein. Es wird einen Weg zur Identifizierung integraler Partner und Zielkomponenten von LEA2-Proteinen in der Zelle aufbauen und so einen erweiterten Einblick in ihr Schutzphänomen für die Toleranz gegenüber Pflanzenstress ermöglichen.

Die PdLEA2-Gene wurden auf verschiedenen Chromosomen in Dattelpalmen kartiert. Basierend auf einer BLAST-Suche anhand der Barhee BC4-Dattelpalmen-Genomassemblierung (GCF_009389715.1) wurde PdLEA2.2 keinem Chromosom zugeordnet, während PdLEA2.3, PdLEA2.4, PdLEA2.6 und PdLEA2.7 verteilt waren die Chromosomen 7, 14, 3 und 2. Die mRNA-Sequenzen wurden in der NCBI GenBank hinterlegt und die mRNA- und Proteinzugänge sind in Tabelle S1 aufgeführt.

Die vorhergesagten Molekulargewichte der PdLEA2-Proteine ​​lagen im Bereich von 22,04 bis 35,43 kDa, wobei PdLEA2.3 das höchste Molekulargewicht von 35,43 kDa mit 317 Aminosäuren und PdLEA2.6 das niedrigste Molekulargewicht von 22,04 kDa mit 202 Aminosäuren hatte (Tabelle 1). Die Analyse der physikalisch-chemischen Eigenschaften ergab, dass die meisten der isolierten PdLEA2-Proteine ​​relativ hohe isoelektrische Punkte (pI > 7) aufwiesen (Tabelle 1), was darauf hinweist, dass die PdLEA2-Proteine ​​größtenteils basisch waren. Der berechnete GRAVY-Index (Tabelle 1), ein Hinweis auf die durchschnittliche Hydrophobie des Proteins, zeigte, dass PdLEA2.7 leicht hydrophob (> 0), PdLEA2.3 und PdLEA2.4 mäßig hydrophil (< 0) und PdLEA2. 2 und PdLEA2.6 hatten einen Wert nahe 0. Die Kyte-Doolittle-Diagramme (Abb. 1A) deuten jedoch bei Ausweitung auf die Restebene auf die Existenz von Abschnitten stark hydrophober Regionen in der Nähe des N-Terminus von PdLEA2.2 hin. PdLEA2.4, PdLEA2.6 und PdLEA2.7. PdLEA2.2, PdLEA2.4, PdLEA2.6 und PdLEA2.7 wurden als instabile Proteine ​​mit einem Instabilitätsindex von 49,27, 43,09, 41,89 bzw. 41,83 klassifiziert. PdLEA2.3 hingegen war mit einem Instabilitätsindex von 21,6 recht stabil. Der aliphatische Index der fünf PdLEA2-Proteine ​​war hoch und lag zwischen 84,4 und 105,5, was darauf hindeutet, dass PdLEA2-Proteine ​​über einen weiten Temperaturbereich thermostabil sind.

Strukturelle Eigenschaften von PdLEA2-Proteinen und ihre Hydropathie. (A) Kyte-Doolittle-Hydropathiediagramme von PdLEA-Proteinen (ProtScale, ExPASy). Die Proteine ​​PdLEA2.2, PdLEA2.3 und PdLEA2.4 zeigen nahezu identische Hydropathiediagramme mit gewissen Variationen am N- und C-Terminus, im Gegensatz zu PdLEA2.6 und PdLEA2.7, die ähnliche Hydropathiediagramme aufweisen. Die mit DISPORED bewertete Störungsneigung von PdLEA2-Proteinen wird in grüner Farbe angezeigt. Der Standardgrenzwert von 0,5 wurde verwendet, um ungeordnete Regionen zu definieren. (B) Sekundärstrukturvorhersage von PdLEA2-Proteinen mithilfe von PSIPRED. Die vorhergesagte α-Helix-Region ist rosa, der β-Strang gelb und die Zufallsspirale grau. Die vom DISOPRED vorhergesagten ungeordneten Regionen sind mit schwarzen Rechtecken markiert. (C) Dreidimensionales Strukturmodell von PdLEA2, entwickelt mit AlphaFold2. Die Proteine ​​werden in Cartoon-Darstellung dargestellt und basierend auf dem pLDDT-Score eingefärbt, wobei blau: pLDDT > 90; Cyan: 70 < pLDDT < 90; gelb: 50 < pLDDT < 90; Orange: pLDDT < 50. Die N- und C-Termini der Proteine ​​sowie die von MEMSTAT vorhergesagte Transmembranregion (TM) sind markiert.

Es wurde eine hohe Ähnlichkeit in der Sekundärstruktur und Störungsneigung der fünf PdLEA2-Proteine ​​festgestellt. Die Vorhersage der Sekundärstruktur der PdLEA2-Sequenzzusammensetzung wurde mit PSIPRED durchgeführt (Abb. 1B; Tabelle 2). Offensichtlich ist der β-Strang mit 38–49 % die vorherrschende gefaltete Sekundärstruktur, was mit der höchsten Zuverlässigkeit vorhergesagt wurde. Zufällige Spulen waren vorhanden und über die gesamte Sequenz verteilt. Allerdings wurde im N-terminalen Bereich aller PdLEA2-Proteine ​​ein langer Abschnitt einer gewundenen Region vorhergesagt, der die Gesamtzusammensetzung dieses Zustands erhöhte und zwischen 31 und 45 % der Strukturen ausmachte.

Da LEA2-Proteine ​​bekanntermaßen intrinsisch ungeordnete Regionen beherbergen, wurde die Störungsneigung von PdLEA2 mithilfe von DISOPRED vorhergesagt. In allen PdLEA2-Sequenzen wurde eine ungeordnete Region unterschiedlicher Länge im N-terminalen Bereich des Proteins identifiziert (Abb. 1A). Darüber hinaus wurde auch eine ungeordnete Region in der Nähe der C-terminalen Region von PdLEA2.3, PdLEA2.4 und PdLEA2.7 identifiziert. Die ungeordneten Regionen, die den PdLEA2-Proteinen entsprechen, sind in Abb. 1B in schwarzen Rechtecken eingeschlossen.

3D-Strukturen von PdLEA2-Proteinen wurden mit AlphaFold2 modelliert, einem auf künstlicher Intelligenz basierenden System zur Vorhersage der Proteinstruktur. Die vorhergesagten Strukturen der fünf Proteine ​​sind in Abb. 1C dargestellt. Wie aus den Abbildungen hervorgeht, wies die N-terminale Region bei allen Proteinen eine ausgeprägte ungeordnete Region auf, für die keine 3D-Struktur vorhergesagt werden konnte. Dies wird durch den niedrigen Wert des vorhergesagten lokalen Distanzdifferenztests (pLDDT) angezeigt, einem Indikator für das Vertrauen auf Restebene in die vorhergesagte Struktur in dieser Region. Insgesamt scheinen alle fünf PdLEA2-Proteine ​​strukturell eine konservierte Architektur zu haben, die aus einer ungeordneten N-terminalen Region, gefolgt von einer α-Helix und einer Tertiärstruktur bestehend aus zwei gestapelten β-Faltblättern besteht. Bemerkenswerterweise ist die gestapelte β-Faltblattstruktur im Fall von PdLEA2.3 dupliziert.

Eine überlappende Region mit hoher Hydrophobie (Abb. 1B) und Helizität (Abb. 1A) wurde in jedem der PdLEA2-Proteine ​​im Anschluss an die vorhergesagte ungeordnete Region (Abb. 1B) vorhergesagt. Um zu beurteilen, ob sich die PdLEA2-Proteine ​​in der Membran lokalisieren könnten, wurden daher mehrere Tools zur Vorhersage von Transmembrandomänen – MEMSTAT, DeepTMHMM und TOPCONS – verwendet, um Transmembranregionen in PdLEA2 vorherzusagen (Tabelle 2). Interessanterweise deuteten alle diese Prädiktoren darauf hin, dass es sich bei der oben identifizierten hydrophoben Helix möglicherweise um eine Transmembran-α-Helix handelt. Die einzige Diskrepanz scheint in PdLEA2.3 zu bestehen, wo es keinen Konsens zwischen den Ergebnissen der drei Prädiktoren gab. Darüber hinaus deuteten die Prädiktoren darauf hin, dass die ungeordnete N-terminale Region der PdLEA2-Proteine ​​intrazellulär liegt, während sich die β-Strang-reiche Region außerhalb der Zelle befindet.

Konservierte Domänen in den PdLEA2-Sequenzen wurden mithilfe der CD-Suche anhand der Conserved Domain Database (CDD) des NCBI identifiziert. Es wurde festgestellt, dass die Proteine ​​PdLEA2.2, PdLEA2.4, PdLEA2.6 und PdLEA2.7 eine vollständig konservierte Domäne der LEA_2-Superfamilie beherbergen. Währenddessen wurde beobachtet, dass PdLEA2.3 zwei Wasserstress- und Hypersensitive-Reaktionsdomänen (WHy) aufweist, die ebenfalls zur LEA_2-Superfamilie gehören (Tabelle 3). Alle identifizierten konservierten Domänen (pfam03168 und smart00769) sind Mitglieder der cl12118 LEA_2-Superfamilie. Darüber hinaus identifizierte MEME das Vorhandensein von 4 statistisch signifikanten konservierten Motiven innerhalb der PdLEA2-Sequenzen (Tabelle 4). Allerdings wurde nur ein konserviertes Motiv mit einer Konsensussequenz von DVLIRNPN von allen fünf Sequenzen gemeinsam genutzt.

Das globale Mehrfachsequenz-Alignment der PdLEA2-Proteinsequenzen führte zu einer geringen Sequenzidentität zwischen 8,28 und 26,41 %, was auf eine schlechte Gesamtsequenzkonservierung hinweist, die für die LEA2-Superfamilie charakteristisch ist. Diese Sequenzunterschiede hindern es jedoch nicht daran, eine ähnliche dreidimensionale Falte wie zuvor besprochen zu erzeugen. Eine Suche aller Dattelpalmen-Proteinsequenzen in der NCBI RefSeq-Proteindatenbank, die ein Mitglied der LEA-Superfamilie-Sequenz enthält, ergab, dass die meisten dieser Sequenzen weder gut charakterisiert noch angemessen annotiert wurden. Es ist unnötig, dass mithilfe von PdLEA2-Sequenzen ein phylogenetischer Baum erstellt wurde (Abb. S1). Es wurde festgestellt, dass PdLEA2.2 in der Nähe des NDR1/HIN1-ähnlichen Proteins 6 liegt, PdLEA2.3 in der Nähe des Lea14-A-Proteins, PdLEA2.4 in der Nähe des NDR1/HIN1-ähnlichen Proteins 10 und PdLEA2.7 in der Nähe des NDR1/HIN1-ähnlichen Proteins. wie Protein 1, während PdLEA2.6 bei Proteinen lokalisiert wurde, die als nicht charakterisiert gekennzeichnet waren.

Für die Echtzeit-PCR wurden RNA-Proben aus Wurzeln und Blättern zweier gegensätzlicher Genotypen verwendet, die unter Kontroll- und Salzstressbedingungen gezüchtet wurden. Sowohl bei der salzempfindlichen Dattelpalmensorte Khalas als auch bei der toleranten Dattelpalmensorte Lulu zeigte die Expression der Gene PdLEA2.2, PdLEA2.3 und PdLEA2.4 unter Salzstress einen signifikanten Anstieg (p < 0,05). sowohl in Wurzeln als auch in Blättern, im Vergleich zu den nicht gestressten Kontrollpflanzen (Abb. 2A-B). Allerdings zeigte die Expression der PdLEA2-Gene in Wurzeln unter Kontroll- oder Salzstressbedingungen keinen signifikanten Unterschied zwischen den toleranten und den empfindlichen Sorten (Abb. 2A). Im Gegensatz dazu wurde in Blättern unter Salzstress ein signifikanter Unterschied zwischen dem Expressionsniveau der PdLEA2-Gene zwischen den toleranten und den empfindlichen Sorten beobachtet, jedoch nicht unter den Kontrollbedingungen (Abb. 2B). Das Expressionsniveau der PdLEA2-Gene war bei beiden Genotypen in Blättern höher als in Wurzeln.

Expressionsprofil der PdLEA2-Gene der Sorten Lulu und Khalas unter Salzstress. (A) Wurzeln (B) Blätter. Die Daten zum Expressionsniveau sind die Mittelwerte ± SD (n = 3) aus den Wurzeln und Blättern, analysiert mit Einweg-ANOVA und Tukeys HSD-Test. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf einen signifikanten Unterschied in den Expressionsniveaus hin (p < 0,05).

Die PdLEA2.2-, PdLEA2.3- und PdLEA2.4-ORFs wurden im Leserahmen mit dem Polyhistidin-Tag des pET28a-Expressionsvektors kloniert. Rekombinante PdLEA2-Proteine ​​wurden in E. coli-Zellen (Stamm BL21) exprimiert und mittels SDS-PAGE bewertet. Nach der Induktion mit IPTG akkumulierten PdLEA2-Proteine ​​​​in großen Mengen in den E. coli-Zellen (Abb. 3A; Abb. S2). Zur Reinigung der überexprimierten PdLEA2-Proteine ​​wurde die Affinitätschromatographie mit einer Nickelsäule verwendet. Die Reinheit der PdLEA2-Proteine ​​wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Anti-His6-Antikörpers überprüft (Abb. 3B; Abb. S2). Wie erwartet zeigte der Immunblot eine Bande für die PdLEA2-Proteine, jedoch nicht bei der Kontrolle.

SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse der Expression und Reinigung von PdLEA2-Proteinen. (A) SDS-PAGE-Profil rekombinanter Proteine, Spur 1 ist die Proteinleiter, Spuren 2, 3 und 4 sind induzierte Proben von PdLEA2.4, PdLEA2.3 und PdLEA2.2 und Spur 5 ist die Kontrolle. (B) Western-Blot von 1-Kontroll-, 2-PdLEA2.4-, 3-PdLEA2.3- und 4-PdLEA2.2-Proteinen, identifiziert mit einem His6-Tag-spezifischen Antikörper.

Die Fähigkeit von PdLEA2.2, PdLEA2.3 und PdLEA2.4, den LDH-Aktivitätsverlust nach Hitzestress zu hemmen, wurde getestet. Die Wirkungen der Proteine ​​PdLEA2.2, PdLEA2.3 und PdLEA2.4 wurden mit BSA, einem unspezifischen Schutzmittel, und mit pufferbehandeltem LDH-Enzym ohne Proteinzusatz verglichen (Abb. 4A-C). Nach 10 Minuten Hitzestress wurde bei den Massenverhältnissen 1:1, 1:20 und 1:40 ein signifikanter Unterschied (p < 0,001) in der Stabilisierung des LDH-Enzyms mit den PdLEA2-Proteinen im Vergleich zu BSA und beobachtet Puffer ohne zusätzliches Protein. Es wurde festgestellt, dass PdLEA2-Proteine ​​LDH stärker abschirmten als BSA und Puffer, wobei der höchste Schutz für PdLEA2.2 beobachtet wurde, 90 % bei 1:1 und 115 % bei 1:40 innerhalb von 10 Minuten nach der Hitzebelastung (Abb . 4A). Es wurde beobachtet, dass die Hälfte der LDH-Enzymaktivität mit Puffer nach 10-minütigem Erhitzen auf 50 °C verloren ging. In ähnlicher Weise gab es nach 20 Minuten Hitzestress auch einen signifikanten Unterschied (p < 0,001) zwischen der LDH-Enzymaktivität mit PdLEA2-Proteinen im Vergleich zu BSA und dem Puffer ohne Zusatz von Proteinen bei den drei Massenverhältnissen (Abb. 4B). . Der Prozentsatz der Wiederherstellung der enzymatischen Aktivität war für das PdLEA2.2-Protein am höchsten und nahm mit steigendem Massenverhältnis der Proteine ​​zu, nämlich 65 % (1:1) und 115 % (1:40). Darüber hinaus wurde innerhalb von 30 Minuten der Enzymaktivität unter Hitzestress (Abb. 4C) ein signifikanter Unterschied (p < 0,001) zwischen der Wiederherstellungsaktivität von PdLEA2-Proteinen, BSA und Puffer ohne Proteine ​​bei einem Massenverhältnis von 1:1 und 1:20 beobachtet. Bei einem Massenverhältnis von 1:40 und nach 30 Minuten Hitzestress gab es jedoch einen signifikanten Unterschied (p < 0,001) zwischen den PdLEA2-Proteinen und dem Puffer ohne Proteine, es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen der durch PdLEA2 bereitgestellten Stabilisierung beobachtet Proteine ​​und BSA. Beim höchsten Massenverhältnis (1:40) und nach 30 Minuten bei 50 °C schützte PdLEA2.2 mindestens 90 % der enzymatischen Aktivität, während PdLEA2.3 und PdLEA2.4 86 % bzw. 84 % der Enzymaktivität bewahrten , jeweils. Während die Wiederherstellung der Enzymaktivität beim BSA auf 80 % und beim Puffer ohne Protein auf 20 % reduziert wurde. Dies deutete darauf hin, dass die LEA2-Proteine ​​die Enzymaktivität stabilisierten, ohne dass die Anwesenheit eines zweiten unspezifischen Proteins bei den unterschiedlichen Massenverhältnissen und längeren Inkubationszeiten Auswirkungen hätte. Somit wurde beobachtet, dass die enzymatische Aktivität von LDH nach 10 Minuten, 20 Minuten oder 30 Minuten Hitzestress bei Anwesenheit von PdLEA2-Proteinen in den Massenverhältnissen 1:1, 1:20 und 1:40 vollständig geschützt war .

PdLEA2 schützt LDH vor Inaktivierung und verhindert im Gegensatz zu BSA und Puffer dessen Aggregation unter Hitzestress. Erholung der LDH-Enzymaktivität während des Erhitzens auf 50 °C für (A) 10 Minuten, (B) 20 Minuten und (C) 30 Minuten. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) ausgedrückt und mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA analysiert. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf einen signifikanten Unterschied (p < 0,05) hin, der mit dem HSD-Test von Tukey bewertet wurde.

Das LDH-Enzym bildet Aggregate, wenn es Dehydrierungs-, Erhitzungs- oder Gefrier-Tau-Behandlungen ausgesetzt wird. Diese Studie untersuchte die Fähigkeit von PdLEA2-Proteinen, die Aggregation des LDH-Enzyms unter Hitzestressbedingungen zu verringern, indem die scheinbare Lichtstreuabsorption von Proteinlösungen gemessen wurde. Der Einfluss von PdLEA2-Proteinen auf die Enzyme wurde bei zwei Massenverhältnissen von 1:1 und 1:2 untersucht. Es wurde beobachtet, dass LDH nach 20-minütigem Erhitzen auf 80 °C eine massive Aggregation bildete. Bei beiden Massenverhältnissen gab es einen signifikanten Unterschied (p < 0,001) in der Hemmung der LDH-Aggregatbildung unter Hitzestress durch Zugabe von PdLEA2-Proteinen und BSA (Abb. 5). Das Vorhandensein der PdLEA2-Proteine ​​​​verlangsamte die enzymatische Aggregation von LDH bei beiden Massenverhältnissen im Gegensatz zum BSA (Abb. 5). Beim enzymatischen Assay unter Hitzestress wurde die Absorption in Gegenwart von PdLEA2 in beiden Massenverhältnissen um mehr als die Hälfte der Aggregatbildung in Gegenwart von BSA verringert (Abb. 5). Es wurde festgestellt, dass die LDH-Aggregation bei einer ähnlichen Aktivitätsrate zwischen den drei PdLEA2-Proteinen durchweg geringer war.

LDH-Antiaggregationsaktivität von PdLEA2 unter Hitzestress. Die enzymatische Aggregation wurde im Spektrophotometer bei einer Absorptionsrate von 340 nm überwacht. PdLEA2-Proteine ​​und BSA wurden der enzymatischen LDH-Reaktion in zwei unterschiedlichen Massenverhältnissen zugesetzt. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SD (n = 3), wobei verschiedene Buchstaben einen signifikanten Unterschied (p < 0,05) anzeigen, analysiert mit dem HSD-Test von Tukey nach einfaktorieller ANOVA.

Um die schützende Wirkung von PdLEA2-Proteinen auf die enzymatische Aktivität von bglG bei 70 °C zu testen, wurden der Reaktion des bglG-Enzyms rekombinante PdLEA2.2-, PdLEA2.3- und PdLEA2.4-Proteine ​​(0,5 µg ml−1) zugesetzt. Die Behandlungen wurden mit und ohne PdLEA2-Proteine ​​in Zeitintervallen von 15 Minuten bis zu 90 Minuten durchgeführt. Ein signifikanter Unterschied (p < 0,001) wurde in der enzymatischen Aktivität mit und ohne PdLEA2-Proteine ​​in den verschiedenen Zeitintervallen der Hitzestressreaktion beobachtet (Abb. 6). Die bglG-Enzymaktivität nahm in Abwesenheit von PdLEA2-Proteinen innerhalb von 30 Minuten drastisch auf 22 % ab, während festgestellt wurde, dass das PdLEA2.2-Protein im gleichen Zeitintervall 90 % der Enzymaktivität beibehielt. Im Gegensatz dazu konservierten die Proteine ​​PdLEA2.3 und PdLEA2.4 nach 30 Minuten Hitzestress 71 % bzw. 55 % der Enzymaktivität. Darüber hinaus wurden nach 60-minütiger Inkubation 65 % der relativen Enzymaktivität durch PdLEA2.2 stabilisiert, 46 % bzw. 33 % durch PdLEA2.3 und PdLEA2.4. Während sie ohne die PdLEA2-Proteine ​​nach 60-minütiger Hitzebelastung auf 15 % zurückging. Nach 90 Minuten Hitzestress wurde beobachtet, dass die bglG-Enzymaktivität in Abwesenheit von PdLEA2-Proteinen auf 5 % reduziert war und in Gegenwart von PdLEA2.2, PdLEA2.3 und PdLEA2.4 die bglG-Enzymaktivität sank zu 33 %, 20 % bzw. 10 % konserviert. Dieser Befund weist darauf hin, dass PdLEA2-Proteine ​​unter Hitzestress eine konservierende Wirkung auf bglG haben und bei höheren Temperaturen im Gegensatz zur alleinigen Verwendung von bglG für eine erhöhte Aktivität des Enzyms sorgen.

Einfluss von PdLEA2-Proteinen auf die enzymatische Thermostabilität von bglG. Das bglG-Enzym wurde mit und ohne PdLEA2-Proteine ​​bei 70 °C inkubiert, wobei das Enzym seine katalytische Aktivität verliert. Die relative Aktivität wurde durch die Entnahme von Aliquots in unterschiedlichen Zeitintervallen bestimmt. Die Daten sind die Mittelwerte ± SD (n = 3).

In Pflanzen wurden LEA2-Proteine ​​funktionell charakterisiert und sind an Reaktionen auf Umweltstress verschiedener Pflanzen beteiligt, insbesondere dürretoleranter Pflanzen23, Halophyten24, Auferstehungspflanzen15 und kältetoleranter Pflanzen25. In dieser Studie wurden LEA2-Proteine ​​von P. dactylifera identifiziert, charakterisiert und zum ersten Mal auf ihre mögliche Auswirkung auf die Enzymstabilität und Thermotoleranz untersucht.

Die LEA2-Gene sind in der Genomanordnung von P. dactylifera mit 62 Mitgliedern reichlich vorhanden, im Vergleich zu 52 bzw. 46 in Reis und Sorghum17. Darüber hinaus gab es dreißig LEA2-Gene in Prunus salicina26, siebenundzwanzig in Solanum lycopersicum27, dreiundfünfzig in Populus28, neunundzwanzig in Solanum tuberosum29 und zweiunddreißig in der Teepflanze4. Im Gegensatz dazu war die Anzahl der LEA2-Gene bei Ramonda serbica20 und Arachis hypogaea30 mit 127 bzw. 78 Mitgliedern viel höher. Die Häufigkeit der LEA2-Gene in Dattelpalmen kann als die letzten Mitglieder angesehen werden, die sich innerhalb der LEA-Gengruppe entwickelt haben, oder als Folge des gesamten Genduplikationsereignisses innerhalb dieser Gruppe, wie es bei Baumwollpflanzen auftrat9. Die hohe Häufigkeit oder Redundanz einer bestimmten Gengruppe weist darauf hin, dass sie eine wichtige Rolle bei der Verbesserung des Überlebens der Pflanzen spielt. Der Dattelpalmenanbau in den Trockengebieten ist ständig rauen Umweltbedingungen ausgesetzt. Ihr Wachstum unter Umweltbelastungen kann auf die Anhäufung verschiedener stresstoleranter LEA2-Gene oder auf die Integration dieser Gene mit mehreren anderen Genregulationsmechanismen zur Aktivierung adaptiver Reaktionen zurückgeführt werden.

Die Position eines Gens auf dem Chromosom spielt eine wesentliche Rolle bei der Gestaltung der Merkmale eines Organismus und seiner Entwicklung. Die PdLEA2-Gene waren weit verbreitet und auf verschiedenen Chromosomen im Dattelpalmengenom lokalisiert. Der Bereich der Aminosäuresequenz der identifizierten PdLEA2-Proteine ​​lag zwischen 202 und 317 aa, was größer ist als in Lorbeerbohnen31 und Teepflanzen32, liegt aber in der Nähe der DHNs von Rhododendron catawbiense, RcDhn 1–533. Allerdings war das Molekulargewicht der PdLEA2-Proteine ​​kleiner als das von A. thaliana34 und Cotton9, die jeweils zwischen 67,2 und 160,7 kDa lagen. Die pI-Werte der PdLEA2-Proteine ​​lagen zwischen 4,85 und 9,96, was darauf hinweist, dass die isolierten PdLEA2-Proteine ​​basischer Natur waren, ähnlich den LEA2-Proteinen von Brachypodium distachyon35 und den LEA2-Proteinen von Weizen36. Der durchschnittliche pI der PdLEA2-Proteine ​​zeigte eine höhere Assoziation mit den LEA-Gruppen von G. hirsutum, insbesondere DHNs und SMPs9.

In Bezug auf die Hydrophobie zeigten die GRAVY-Werte, dass zwei der Proteine, PdLEA2.3 und PdLEA2.4, mäßig hydrophil waren, während PdLEA2.7 hydrophob war und PdLEA2.2 und PdLEA2.6 dazwischen lagen. Bemerkenswerterweise deuteten Kyte-Doolittle-Diagramme auf das Vorhandensein eines langen Abschnitts einer hydrophoben Region hin, von der vorhergesagt wurde, dass sie eine Transmembranhelix bildet. Die moderate hydrophile Natur der PdLEA2.3- und PdLEA2.4-Proteine ​​kann es ihnen ermöglichen, eine Wasserstoffbindung mit Wassermolekülen zu bilden und sich dadurch in Wasser aufzulösen, was eine thermodynamisch begünstigte Wechselwirkung darstellt. Die hydrophile Eigenschaft wurde zuvor bei LEA2-Proteinen anderer Pflanzen beobachtet37. Dadurch können sie ganz oder teilweise ungeordnet werden, ein einzigartiges Merkmal der LEA-Proteine. Die hydrophile Eigenschaft ist außerdem erforderlich, um flexible Strukturelemente wie molekulare Chaperone zu bilden, die für den Schutz der Pflanze vor Austrocknung unerlässlich sind38. Andererseits ermöglicht die hydrophobe Natur der PdLEA2.7-Proteine ​​ihnen, sich spontan zu komplexen Strukturen zu falten und darüber hinaus die Freisetzung unpolarer Aminosäuren aus den Lösungsmitteln zu ermöglichen. Diese Eigenschaft tritt häufig bei Wasserkanalproteinen wie Aquaporinen (AQPs) auf, die stark hydrophob sind und eine wichtige Rolle bei der Trockenheits- und Salzstresstoleranz von Pflanzen spielen39. Der Instabilitätsindex zeigte, dass die meisten der isolierten PdLEA2-Proteine ​​instabil waren, im Gegensatz zu denen von Sorghum bicolor LEA, SbLEA und S. lycopersicum LEA, SiLEAs, die dem stabilen PdLEA2.3-Protein ähnelten27,40. PdLEA2-Proteine ​​​​wiesen einen hohen Aliphatenindex auf, was darauf hindeutet, dass ihr relatives Volumen größtenteils von aliphatischen Seitenketten wie Alanin, Isoleucin, Leucin und Valin eingenommen wird, was ihre Thermostabilität erhöht. LEA-Proteine ​​sind keine Transmembranproteine, da sie im Zellkern, im Chloroplasten, in den Mitochondrien und im Zytoplasma vorkommen können41. Im Gegensatz dazu wiesen PdLEA2-Proteine ​​​​Transmembranhelices auf, was auf ihre Expression in subzellulären Kompartimenten hinweist. Das Vorhandensein mindestens einer Transmembran-α-Helix wurde in ähnlicher Weise in LEA2-Proteinen von R. serbica identifiziert20.

Die konservierte Domänenanalyse von PdLEA2-Proteinen ergab das Vorhandensein einer LEA_2-Superfamiliendomäne, pfam03168, in PdLEA2.2, PdLEA2.4 und PdLEA2.7. Diese LEA_2-Domänen enthaltenden Proteine ​​wurden mit verschiedenen Pflanzentoleranzreaktionen gegen verschiedene abiotische Stressfaktoren wie Hitze, Trockenheit, Salzgehalt, osmotischer Stress, UV-Schäden und oxidativen Stress in Zusammenhang gebracht42,43,44,45. Darüber hinaus bestand PdLEA2.3 aus der WHy-Domäne und der LEA_2-Superfamilie smart00769. Das Vorhandensein der WHy-Domänensequenz wurde als ORF in bestimmten Bakteriengenomen des Stammes Firmicutes gefunden46. Es wurde berichtet, dass das rekombinante bakterielle WHy-Protein in E. coli einen Stresstoleranz-Phänotyp aufwies und in vitro Schutz vor Proteindenaturierung bot46. Die Proteindenaturierung bedeutet eine Schädigung der Tertiärstruktur, was zum Verlust der Stabilität und Struktur des Proteins führt. Darüber hinaus verfügten PdLEA2.4 und PdLEA2.6 über die Domäne der LEA_2-Superfamilie, cl12118, die auch in Baumwoll-LEA2-Proteinen identifiziert wurde9.

Die meisten LEA2-Proteine ​​weisen typische Motive auf, die für ihre Identifizierung wesentlich sind. In PdLEA2-Proteinen wurden vier unterschiedliche Motive gefunden. Die Motivlänge variierte zwischen 8 und 24 Aminosäuren. Das Motiv 2 kam in allen PdLEA2-Proteinen vor, während das Motiv 1 nur in den Proteinen PdLEA2.2 und PdLEA2.4 vorkam. In ähnlicher Weise war in PdLEA2.2, PdLEA2.4 und PdLEA2.6 nur das konservierte Motiv 3 vorhanden. Darüber hinaus wurde Motiv 4 in PdLEA2.2, PdLEA2.4 und PdLEA2.7 gefunden. Das Vorhandensein einer gemeinsamen Motivzusammensetzung weist auf eine identische funktionelle Spezifität innerhalb der Untergruppe der PdLEA2-Proteine ​​hin, wie sie in S. tuberosum identifiziert wurde47. Identische Ergebnisse der gruppenspezifischen konservierten Motive von LEA-Proteinen wurden bereits früher für Arabidopsis34, S. lycopersicum27, Prunus26, Pappel28, Mais48, Brassica49 und Baumwolle9 berichtet.

Bei den LEA2-Proteinen handelt es sich vermutlich um IDPs6. Die Sekundär- und 3D-Strukturanalyse aller fünf PdLEA2-Proteine ​​zeigte eine ungeordnete Region an der N-terminalen Stelle. Dieser Region folgten eine α-Helix und eine Tertiärstruktur bestehend aus drei β-Haarnadeln und β-Strängen. Somit war die am häufigsten gefaltete Sekundärstruktur der β-Strang mit zufälligen Knäueln, die über die gesamten PdLEA2-Proteinsequenzen verteilt waren. Die Struktur der PdLEA2-Proteine ​​ähnelte der Vorhersage der Sekundärstruktur in Lorbeerbohnen- und R. serbica-LEA-Proteinen in Bezug auf β-Faltblatt-, α-Helix- und Random-Coil-Gehalt31. Dies steht jedoch im Widerspruch zu den Weizen-LEA-Proteinen, die niedrigere β-Faltblattstränge aufwiesen36.

Aufgrund der fehlenden Validierung und guten Annotation für LEA2-Proteine ​​zeigte der phylogenetische Baum, der mithilfe von Dattelpalmen-Proteinsequenzen erstellt wurde, die Mitglieder der LEA2-Superfamilie beherbergen, dass sich PdLEA2-Proteine ​​in den meisten Fällen neben Proteinen befanden, die als NDR1/HIN1-ähnlich annotiert waren Das Genom der Dattelpalme. Zu den NDR1/HIN1-like (NHL)-Gengruppen gehören das Harpin-induzierte Gen 1 (HIN1) und das Nonrace-spezifische Krankheitsresistenzgen 1 (NDR1)50. HIN1 wird von einem Harpin-Protein akkumuliert, das an verschiedenen Abwehrreaktionen der Pflanzen auf abiotischen Stress beteiligt ist50. Die Klonierung des NDR1-Gens aus A. thaliana zeigte dagegen, dass es auf die Resistenz gegen Pflanzenkrankheiten reagiert51.

LEA2-Gene werden größtenteils als Reaktion auf abiotischen Stress in Pflanzen exprimiert6. In dieser Studie zeigten PdLEA2-Gene nach Behandlungen mit Salzstress eine relativ höhere Expression in Blättern der toleranten und empfindlichen Sorten Lulu- und Khalas-Sämlinge. Dieser Befund steht im Einklang mit der Expression von LEA-Genen in vegetativen Geweben von Baumwoll-, S. bicolor- und Maispflanzen9,40,48. Blätter sind die wichtigsten Pflanzenteile, die dem Salzstress ausgesetzt sind. Die erhöhte Anreicherung von PdLEA2-Transkripten im Blattgewebe weist auf ihre Rolle bei der Erhaltung der strukturellen Integrität und der Verhinderung von Salzschäden an den Membranen hin. Darüber hinaus sind Blätter wichtige Orte für die Photosynthese, die durch die übermäßige Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) unter Salzstress beeinträchtigt werden52. ROS sind schädlich für das Pflanzenwachstum und eine hohe Expression der PdLEA2-Gene in den Blättern. Dies deutet darauf hin, dass sie an der Abfangung der ROS durch die Steigerung der Aktivitäten antioxidativer Enzyme beteiligt sind, ähnlich dem LEA5-Gen von Oryza sativa53.

Proteindenaturierung ist ein häufiges physiologisches Phänomen, das in Pflanzenzellen auftritt, die abiotischem Stress ausgesetzt sind. Verschiedene Faktoren beeinflussen die enzymatischen Aktivitäten wie Temperatur, pH-Wert, Substrat- und Enzymkonzentrationen sowie die Anwesenheit oder Abwesenheit von Inhibitoren und Aktivatoren in der Reaktion. Über die thermische Stabilisierung der Enzymaktivität wie Glucoseoxidase (GOD) wurde in Gegenwart von Trehalose berichtet, einem bekanntesten kompatiblen gelösten Stoff, der als chemisches Chaperon fungiert54. In der vorliegenden Studie wurde festgestellt, dass PdLEA2-Proteine ​​die enzymatischen Aktivitäten von LDH und bglG vor Schäden durch Hitzestress während ihrer Reaktionsbedingungen schützten. Das Vorhandensein von PdLEA2-Proteinen ermöglichte eine höhere Wiederherstellung der enzymatischen Aktivitäten von LDH und bglG unter Hitzestress, was darauf hindeutet, dass die isolierten PdLEA2-Proteine ​​eine starke Fähigkeit zum Schutz der Enzyme haben. Der enzymatische Schutz der LEA2-Proteine ​​war effizienter als durch BSA. Dies kann auf die Störungsstruktur, die Transmembranhelix und den gefalteten Bereich zurückgeführt werden, der aus β-Faltblättern von PdLEA2-Proteinen während des Hitzestresses besteht, oder auf ihre Fähigkeit, als Chaperone zu fungieren und an Membranen, Metallionen und Wasser zu binden. Der Verlust der katalytischen Aktivität von LDH und bglG blieb nicht nur erhalten, sondern PdLEA2-Proteine ​​verhinderten darüber hinaus die Aggregation des LDH-Enzyms. Insbesondere während des Trocknens wurde bei anderen LEA-Proteinen aus Pflanzen eine Abnahme der Aggregation festgestellt, was mit der Hypothese einer molekularen Abschirmung in Verbindung gebracht wurde55. Mehrere Studien haben gezeigt, dass DHNs die LDH- und bglG-Enzymaktivitäten vor Schäden durch verschiedene Belastungen schützen können. In Bezug auf PdLEA2-Proteine ​​wurde festgestellt, dass CdDHN4-L und CdDHN4-S die LDH-Enzymaktivitäten während Schäden durch freies Auftauen und Hitzestress wiederherstellten56. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Enzymaktivität von Picea Wilsonii DHN, PicW1 und LDH bei 43 °C bis 55 °C höher war als bei der Blindkontrolle und BSA57. Alternativ verursachen die Bedingungen von Hitze- und Gefrierstress Wasserstress, und es wurde festgestellt, dass bestimmte DHNs unter diesem Stress die Rolle von Antiaggregationsmitteln für die anderen Protein- oder Enzymmoleküle spielen58. Die Funktion der PdLEA2-Proteine ​​beim Schutz der Enzymaktivitäten während Hitzestress war ähnlich wie die des Weizen-LEA3-Proteins TdLEA355. Tatsächlich bewahrte die Zugabe von TdLEA3 im höchsten Massenverhältnis in der Reaktion 90 % der LDH-Enzymaktivität bei 48 °C nach 30 Minuten. Die Strukturdomänen von LEA2-Proteinen und der Mechanismus, der den Schutz der enzymatischen Aktivität unter Stressbedingungen steuert, wurden in wenigen Studien als Hitzeschutzmechanismus von LEA2-Proteinen untersucht. In Brassica napus schützten LEA3-Proteine ​​LDH unter Austrocknungsstress, was auf seine hydrophile Natur, β-Faltblätter, α-Helix und die Neigung zu zufälligen Knäueln zurückgeführt wurde38. In der vorliegenden Studie waren PdLEA2.2, PdLEA2.3 und PdLEA2.4 mäßig hydrophil, hatten β-Faltblätter und eine Neigung zu zufälligen Knäueln, was möglicherweise zum Schutz des LDH-Enzyms unter Hitzestress beigetragen hat. Darüber hinaus kam es in Arabidopsis COR1559 im Kryoprotektionsassay zur Bildung einer zufälligen Knäuelstruktur, was auf die Rolle der zufälligen Knäuelstruktur bei der Kryoprotektion der Enzyme hinweist. Es wurden nur wenige Studien zur Untersuchung der Rolle von LEA2-Proteinen beim Schutz des bglG-Enzyms unter Hitzestress durchgeführt. In unserer vorherigen Studie haben wir herausgefunden, dass DHN-5 aus Weizen eine relevante Rolle beim Schutz des Enzyms bglG vor Hitzestress spielt60. Der Trunkierungstest von DHN-5 zeigte, dass K-Segmente für den thermischen Schutz von LDH und bglG61 von entscheidender Bedeutung sind. Es wurde beobachtet, dass die verkürzten Formen von DHN-5, die nur ein oder zwei K-Segmente enthielten, die enzymatischen Aktivitäten von LDH und bglG in vitro vor Schäden durch verschiedene Belastungen schützen konnten, wenn auch in geringerem Maße als das Wildtyp-Protein. Neben der Wirkung von K-Segmenten auf die Verbesserung der LDH- und bglG-Wärmestabilität falteten diese verkürzten Formen die Enzyme nach Hitzestress wie das Wildtyp-Protein ordnungsgemäß zurück. Allerdings fehlt den PdLEA2-Proteinen jegliches K-Segment und sie schützten die bglG-Enzymaktivität, was auf eine mögliche Rolle der Hydrophilie und der β-Faltblattstruktur beim Schutz des bglG-Enzyms unter Hitzestress hinweist.

In dieser Studie wurden LEA2-Proteine ​​aus Dattelpalmen charakterisiert und die Funktionsanalyse klärte ihre Rolle beim Schutz von Enzymen auf. Die PdLEA2-Proteine ​​​​wiesen eine hohe Sequenzähnlichkeit und Hydrophilie auf und waren in ihrer Struktur ungeordnet. Es wurde festgestellt, dass die isolierten PdLEA2-Proteine ​​aus Dattelpalmen die enzymatische Stabilität und Aktivität der LDH- und bglG-Enzyme unter Hitzestress schützen. Die schützende Rolle von PdLEA2-Proteinen kann auf ihrer gestörten Struktur, Transmembranhelix und gefalteten Region bestehend aus β-Faltblättern beruhen, die es ihnen ermöglicht, verschiedene Partnermoleküle wie Enzyme oder Zielproteine ​​in verschiedenen Zellkompartimenten während des Hitzestresses zu stabilisieren. Die Fülle der LEA2-Gene in Dattelpalmen und ihre funktionelle Charakterisierung bilden eine wichtige Grundlage für weitere Forschungen zum Verständnis der evolutionären Beziehung der LEA2-Genfamilie und ihrer möglichen Rolle bei der Toleranz von Pflanzen gegenüber abiotischen Stressbedingungen. Darüber hinaus bietet die Erzeugung transgener Pflanzen, die PdLEA2-Gene überexprimieren, Schutz vor Umwelteinflüssen wie Salzgehalt, Trockenheit und Hitzestress. Darüber hinaus wird die Verwendung der Fermentation für das Wachstum großer Bakterienzellen zur Steigerung der Produktion rekombinanter PdLEA2-Proteine ​​als potenzielle Anwendung dieser Studie angesehen. Die vorliegenden Ergebnisse untermauern die Annahme, dass PdLEA2-Proteine ​​lebenswichtige Moleküle sind, die als molekulare Chaperone für die Entwicklung neuartiger rekombinanter thermoresistenter Enzyme mit verbesserter Reaktionsgeschwindigkeit und Spezifität genutzt werden können.

Unsere experimentelle Forschung an kultivierten Dattelpalmen aus Gewebekulturen wurde in Übereinstimmung mit allen geltenden landwirtschaftlichen und genetischen Ressourcengesetzen für die Pflanzenbewirtschaftung durchgeführt. Für die Sammlung des Pflanzenmaterials wurde eine Genehmigung eingeholt und die Versuchsmethoden wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien durchgeführt.

Dattelpalmensämlinge der gewebekultivierten Sorten Lulu und Khalas wurden in ½ MS-Flüssigmedium gezüchtet und in einer Wachstumskammer mit einer Temperatur von 25 ± 2 °C, einer Photoperiode von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit bei 280 μmol Photonen m− gehalten 2 s−1 und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 70 %. Zur Salzbehandlung erhielten die Sämlinge 250 mM NaCl im ½ MS-Flüssigmedium, während die Kontrollsämlinge steriles Wasser erhielten. Die P. dacrylifera-Sämlinge wurden zwei weitere Wochen lang unter den gleichen Umgebungsbedingungen in der Wachstumskammer aufgezogen. Anschließend wurden die Wurzeln der Kontrollpflanzen und der mit Salz behandelten Pflanzen gesammelt und dann zur späteren Analyse bei -80 °C gelagert.

Das P. dactylifera-Genom und die Wurzeltranskriptomdaten der Sorte Khalas wurden zur Identifizierung der LEA2-Gensequenzen verwendet. Alle identifizierten Kandidaten wurden mithilfe der Pfam-Datenbank (http://pfam.sanger.ac.uk) analysiert, um konservierte Domänen zu bestätigen. Fünf PdLEA2-Gene (PdLEA2.2, PdLEA2.3, PdLEA2.4, PdLEA2.6 und PdLEA2.7) wurden ausgewählt und spezifische Primer für die Klonierung der jeweiligen LEA2-Gene entworfen (Tabelle S2).

Die Gesamt-RNA wurde aus den Keimlingswurzeln der Kontroll- und Salzstress-P. dactylifera, Sorte Khalas, gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung des RNeasy® Plant Mini Kit (QIAGEN, Deutschland) isoliert. Das PrimeScript RT-PCR Kit (TaKaRa Bio, Japan) wurde verwendet, um die Erststrang-cDNA aus den isolierten RNAs zu synthetisieren. Die synthetisierten cDNAs dienten als Matrizen für die PCR mit spezifischen Primern, die mit Primer Premier 6.0 entwickelt wurden. Die PCR-Reaktion wurde über 30 Zyklen mit einer anfänglichen Denaturierung von 3 Minuten bei 95 °C, gefolgt von einer Denaturierung von 30 Sekunden bei 95 °C, einem 30-sekündigen Annealing bei 55 °C und einer Verlängerung von 1 Minute bei 72 °C durchgeführt mit einer abschließenden Verlängerung von 7 Minuten bei 72 °C. Die PCR-Produkte wurden vom Agarosegel abgeschnitten und mit Spin-Säulen von GenElute minus Ethidiumbromid (Sigma-Aldrich) gereinigt. Die gereinigten Produkte wurden mit dem NEB PCR Cloning Kit (New England, BioLabs, Inc.) in den pMiniT 2.0-Vektor kloniert und durch Outsourcing mit Macrogen TM (Südkorea) in beide Richtungen sequenziert, um die Sequenz der LEA2-Gene zu überprüfen.

Die Gesamt-RNA wurde aus Blättern und Wurzeln von Kontroll- und salzgestressten P. dactylifera-Sämlingen zweier kontrastierender Sorten, Khalas und Lulu, empfindlich bzw. tolerant, unter Verwendung des RNeasy® Plant Mini Kit (QIAGEN, Deutschland) isoliert. Ein μg Gesamt-RNA aus jeder Probe wurde mit RNase-freier DNase I verarbeitet und gemäß den Anweisungen des Herstellers des SuperScript III Reverse Transkriptase-Kits von Invitrogen revers in cDNA transkribiert. Unter Verwendung der Real-Time-PCR-Maschine von Applied Biosystems wurde eine quantitative Echtzeit-PCR mit SYBRTM Select Master Mix in 96-Well-Platten (Applied Biosystems) durchgeführt. Die PCRs wurden in einem 10-µl-Endvolumen durchgeführt, das 3 µl cDNA (erhalten aus 40 ng DNase-behandelter RNA), 0,5 µl (bei 10 µM) Primer, 5 µl 2 × SYBR Green I-Mastermix und 1 enthielt µl RNase-freies Wasser (Sigma). Der Prozess umfasste eine vorläufige Denaturierung für 10 Minuten bei 94 °C, dann 45 Zyklen mit 94 °C für 10 Sekunden, 59 °C für 10 Sekunden, 72 °C für 15 Sekunden, gefolgt von einer Verflüssigungskurve mit 5 Sekunden bei 95 °C , 1 Minute bei 65 °C und 5 Minuten bei einem Temperaturanstieg von 65 °C auf 97 °C. Die Primer3 Input-Software wurde verwendet, um die Primer für die Echtzeit-PCR zu erstellen, die in Tabelle S3 gezeigt sind. Die Formel: 2-DDCT, wobei DDCT [(CT des Zielgens – CT des Actin-Gens) unter Salzstressbedingungen – (CT des Zielgens – CT des Actin-Gens) unter normalen Bedingungen] ähnelt, wurde zur Berechnung des Relativen verwendet Ausdrucksebene.

Von den fünf isolierten LEA2-Genen aus Dattelpalmen wurden drei aufgrund ihres Hydropathie-Index (mäßig hydrophil) für die Proteinexpression in E. coli ausgewählt. Dementsprechend wurde der ORF voller Länge von PdLEA2.2, PdLEA2.3 und PdLEA2.4 (GenBank-Zugänge: OQ348181, OQ348184, OQ348183) aus der Khalas-cDNA der Dattelpalme mit Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase (New England, Biolabs) amplifiziert. unter Verwendung spezifischer Primer mit hinzugefügten Restriktionsschnittstellen BamHI und EcoRI an den 5′- und 3′-Enden (Tabelle S4). Die PdLEA2.2-, PdLEA2.3- und PdLEA2.4-ORFs wurden in die BamHI- und EcoRI-Stellen des pET28a, Expressionsvektors von E. coli, kloniert. Die rekombinante Proteinexpression von PdLEA2 in E. coli BL21 (DE3) wurde bei 37 °C durch Zugabe von 1 mM Isopropylthio-β-galactosid (IPTG) induziert. Die Kultivierung von E. coli-Zellen wurde weitere 4 Stunden lang durchgeführt, dann geerntet und mit NENT-Puffer (100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % NP40, 20 mM Tris-HCl und pH 7,9), der den Proteaseinhibitor enthielt, lysiert Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Die Proteinreinigung wurde unter Verwendung des HisLink Protein Purification Resin gemäß den Anweisungen des Herstellers (Promega) durchgeführt. Mittels SDS-PAGE wurden fünf μg Protein aus jeder Probe abgetrennt. Proteinbanden wurden durch Coomassie-Blau-Färbung analysiert und durch Western Blot unter Verwendung eines His6-Tag-spezifischen Antikörpers identifiziert.

Das Rinderherz-LDH wurde von Sigma-Aldrich bezogen und mit 10 mM Na3PO4 bei pH 7,4 gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnt. Ein μl von 20 μg/μl LDH wurde in einen Puffer übertragen, der 20 μl PdLEA2 oder BSA in drei verschiedenen Massenverhältnissen (LDH: LEA/BSA) enthielt, nämlich 1:1, 1:20 und 1:40. Die Vakuumtrocknung der Proben erfolgte in einem Speed ​​Vac auf ein Endvolumen von 6 μl, das durch Zugabe von 14 μl Puffer rehydriert wurde. Die Auswirkung des Erhitzens wurde mit einer bis zu 60-minütigen Behandlung der Probe bei 50 °C getestet. Die Enzymaktivität wurde durch Zugabe von einem ml frisch zubereitetem Testpuffer (bei pH 7,4 mit 10 mM Na3PO4, mit 2 mM NADH und 10 mM Brenztraubensäure) zu den LDH-Enzymproben bestimmt. Bei 340 nm wurde eine NADH-Oxidation für 3 Minuten beobachtet, wobei eine lineare Reaktionsgeschwindigkeit vorlag. Die Enzymaktivität wurde anhand der Absorptionsabnahmerate (ΔOD/min) × 8095 = U l−1 berechnet. Die Analyseproben wurden dreifach analysiert.

Die Wirkung von PdLEA2-Proteinen auf die Thermostabilität des bglG-Enzyms wurde getestet, indem gereinigte PdLEA2-Proteine ​​in einer optimalen Konzentration von 0,5 µg ml−1 als Additiv im bglG-Assay für zwei verschiedene Temperaturen verwendet wurden, 50 °C als optimale Temperatur und 70 °C Dabei geht die katalytische Effizienz drastisch verloren. Das Enzym bglG aus Aspergillus niger wurde von Megazyme bezogen und gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die thermische Stabilität von bglG wurde durch Inkubation des gereinigten Enzyms bei den erforderlichen Temperaturen für 30-minütige Intervalle unter Verwendung von 1 mM para-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid als Substrat und anschließender Messung der relativen Aktivität gemessen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,6 ml 0,4 M Glycin-NaOH-Puffer (pH 10,8) gestoppt und das freigesetzte p-Nitrophenol bei 400 nm bewertet. Als molekularer Extinktionskoeffizient von p-Nitrophenol wurde 18.000 M−1 cm−1 verwendet. Eine Einheit enzymatischer Aktivität wurde als die Menge an bglG bestimmt, die erforderlich ist, um unter den Testbedingungen ein Mol p-Nitrophenol pro Minute freizusetzen.

Verschiedene physikalische und chemische Parameter der PdLEA2-Proteine, einschließlich Molekularmasse, theoretischer pI, Instabilitätsindex, aliphatischer Index und Grand Average of Hydropathie (GRAVY), wurden mit Exapsy ProtParam62 bewertet. Die Hydropathieanalyse der PdLEA2-Proteinsequenzen wurde mit Expasy ProtScale basierend auf der Kyte & Doolittle-Skala62 durchgeführt. Ungeordnete Regionen in den Proteinsequenzen wurden mithilfe eines CS-BLAST anhand der Database of Disordered Protein Predictions (D2P2)63 analysiert, die Ergebnisse mehrerer Störungsvorhersagetools und DISOPRED64 zusammenfasst. Konservierte Domänen wurden mit dem CD-Search-Tool von NCBI analysiert und Proteinmotive von PdLEA2-Sequenzen wurden mit Multiple EM for Motif Elicitation (MEME)65 identifiziert. Die Vorhersage der Sekundärstruktur wurde mit PSIPRED66 durchgeführt und Transmembranregionen (TM) wurden mit MEMSTAT67, DeepTMHMM68 und TOPCONS69 vorhergesagt. Modelle der dreidimensionalen Struktur von PdLEA2-Sequenzen wurden mit einer hauseigenen Installation von AlphaFold270 erstellt.

Um einen phylogenetischen Baum der PdLEA2-Proteine ​​zu erstellen, wurden alle verfügbaren P. dactylifera LEA2-Proteinsequenzen aus der NCBI RefSeq-Proteindatenbank abgerufen. Das Vorhandensein der LEA2-Superfamilie wurde in diesen Sequenzen mit dem CD-Search-Tool von NCBI bestätigt. Die erhaltenen und die hier berichteten PdLEA2-Sequenzen wurden mit der MAFFT-Version 4.79071 in Geneious Prime 2022.2.2 (https://www.geneious.com) abgeglichen. Ein phylogenetischer Baum wurde mit dem Simple Phylogeny-Tool von EBI unter Verwendung der Neighbor-Joining-Methode erstellt. Der Baum wurde mit Interactive Tree of Life v572 visualisiert, kommentiert und gerendert.

Statistische Parameter wie Mittelwert und Standardabweichung (SD) wurden für das Expressionsniveau der PdLEA2-Gene und die enzymatischen Aktivitäten von LDH und bglG unter Hitzestressbedingungen mit verschiedenen PdLEA2-Proteinbehandlungen berechnet. Für jeden der enzymatischen Tests und die PdLEA2-Expressionsanalyse wurden drei biologische Replikate verwendet. Die Daten wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit dem HSD-Test von Tukey analysiert, um signifikante Unterschiede zwischen PdLEA2-Proteinen und Kontrollbehandlungen unter Hitzestress zu bewerten. Die Normalität und Homoskedastizität jeder Variablen wurden bewertet. Die Analysen wurden mit der Statistiksoftware R durchgeführt.

Die LEA2-Gensequenzen der Dattelpalme sind bei NCBI DataSets (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) unter den Zugangsnummern verfügbar. OQ348181.1 (PdLEA2.2), OQ348184.1 (PdLEA2.3), OQ348183.1 (PdLEA2.4), OQ348182.1 (PdLEA2.6) und OQ348185.1 (PdLEA2.7). Alle weiteren Studiendaten sind im Artikel und in Zusatzinformationen als ergänzende Dateien enthalten.

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Diese Forschungsarbeit wurde durch Mittel des United Arab Emirates University Research Office-Stipendiums 31R203 und des SURE-Plus-Stipendiums G00003906 an KM unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Mughair Abdul Aziz, Miloofer Sabeem.

Abteilung für integrative Landwirtschaft, Hochschule für Landwirtschaft und Veterinärmedizin, Vereinigte Arabische Emirate, Emirates University, Al-Ain, Abu-Dhabi, VAE

Mughair Abdul Aziz, Miloofer Sabeem, Shafeeq Rahman, Maitha Khalfan Alneyadi, Alia Binghushoom Alkaabi, Eiman Saeed Almeqbali und Khaled Masmoudi

Abteilung für Gemüsewissenschaften, College of Agriculture, Kerala Agricultural University, Vellanikkara, Thrissur, 680656, Indien

M. Sangeeta Kutty

Labor für Biotechnologie und Pflanzenverbesserung, Zentrum für Biotechnologie von Sfax (CBS)/Universität Sfax, Sfax, Tunesien

Faical-Sorge

Abteilung für Biologie, College of Science, Universität der Vereinigten Arabischen Emirate, Al-Ain, Abu-Dhabi, Vereinigte Arabische Emirate

Ranjit Vijayan

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KM, MA und MS hatten die Idee und verfassten das Originalmanuskript. MSK, SR, MA, MS, FB, MKA, ABA und ESA führten die verschiedenen Experimente im Zusammenhang mit Genexpression und enzymatischer Thermotoleranz durch. RV führte die strukturelle und bioinformatische Analyse durch und interpretierte sie. KM und MA führten die Analyse und Interpretation der Ausdrucksdaten durch. KM, MA und RV haben den endgültigen Entwurf überprüft und bearbeitet. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Khaled Masmoudi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Aziz, MA, Sabeem, M., Kutty, MS et al. Enzymstabilisierung und Thermotoleranzfunktion der intrinsisch ungeordneten LEA2-Proteine ​​aus Dattelpalmen. Sci Rep 13, 11878 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38426-w

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Eingegangen: 20. März 2023

Angenommen: 07. Juli 2023

Veröffentlicht: 23. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38426-w

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