Einfluss von prophylaktischem Hydroxychloroquin auf ultrastrukturelle Beeinträchtigungen und zelluläres SARS

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12733 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Viele Medikamente wurden als antivirale Mittel zur Infektionskontrolle und wirksamen Therapie empfohlen, um die Sterblichkeitsrate von COVID-19-Patienten zu senken. Hydroxychloroquin (HCQ), ein Malariamedikament, wird in vielen Ländern, darunter auch Indien, kontrovers zur prophylaktischen Anwendung zur Bekämpfung von SARS-CoV-2-Infektionen empfohlen. Wir haben die Wirkung von prophylaktischem HCQ aus den Zellen bronchoalveolärer Lavageflüssigkeiten von Patienten mit COVID-19-induziertem akutem Atemnotsyndrom untersucht, um das Ausmaß der Infektion und ultrastrukturelle Veränderungen im Flimmerepithel, Typ-II-Pneumozyten, Alveolarmakrophagen, Neutrophilen usw. zu bestimmen entkernte Granulozyten. Die ultrastrukturelle Untersuchung von Flimmerepithel und Typ-II-Pneumozyten zeigte in der prophylaktischen HCQ+-Gruppe weniger Infektionen und Zellbeeinträchtigungen als in der HCQ−-Gruppe. Allerdings zeigten Makrophagen und Neutrophile in beiden Patientengruppen ähnliche Infektionen und ultrastrukturelle Veränderungen. Die entkernten Granulozytenfragmente zeigten eine Phagozytose des ausgereiften Virus in HCQ+-Gruppen. Der vorliegende Bericht enthüllt den ultrastrukturellen Beweis, der das Paradoxon hinsichtlich der Rolle der prophylaktischen HCQ bei COVID-19-Patienten ergänzt.

Der durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) verursachte COVID-19-Ausbruch hat sich schnell ausgebreitet und weltweit fast eine halbe Milliarde infizierte Menschen betroffen1. Es gab kaum Berichte über spezifische und wirksame Behandlungen für diese tödliche Infektion. Aufgrund plötzlicher Ausbrüche und einer sehr hohen Sterblichkeit (29 %)2 durch die Delta-Variante wurden viele Zufallsversuche und Umnutzungen bestehender Medikamente durchgeführt, um die COVID-19-Krankheit zu kontrollieren und zu heilen2,3. Hydroxychloroquin (HCQ), ein Malariamedikament, hat in der Anfangsphase von COVID-19 ab Mai 2020 große Aufmerksamkeit erlangt4,5. Es wurde bereits früher berichtet, dass dieses Medikament (in vitro) die virale Internalisierung (durch Blockierung der proteolytischen Aktivierung des S-Proteins) und die Replikation (Erhöhung der sauren Umgebung des Endosoms zur Hemmung der Virusassemblierung) wirksam reduziert, einschließlich SARS-CoV-2 und MERS-CoV6,7,8. Die Anti-SARS-CoV-2-Wirkung von HCQ (durch Hemmung der Internalisierung und Proliferation) wurde aufgrund seiner Fähigkeit vorgeschlagen, die endosomale Ansäuerung, die Verringerung der Aktivierung von Cathepsin L, die Beeinträchtigung der terminalen Glykosylierung von ACE-2 und die proteolytische Selbstaktivierung von Furin zu erhöhen. und die Blockade der Clathrin-vermittelten Endozytose4,9,10,11. Es wurde vorgeschlagen, dass die immunmodulatorischen Wirkungen, die Alkalisierung des vakuolären pH-Werts, Zinkionophore und die Bindungsfähigkeit von HCQ an Sialinsäuren die COVID-19-Infektion in vitro unspezifisch hemmen9,12,13,14.

In verschiedenen Ländern wurden viele klinische Studien initiiert, um die Wirkung von HCQ bei der Kontrolle und Heilung der COVID-19-Krankheit zu untersuchen15,16,17. Es wurde berichtet, dass HCQ die Vermehrung des SARS-COV-2-Virus unter In-vitro-Kulturbedingungen unter Verwendung von Vero-E6-Zellen mit einer Konzentration von 6,90 µM (EC) sehr wirksam reduzierte9018. Dieses Medikament wurde in China zehn Tage lang zweimal täglich mit 500 mg gegen leichte, mittelschwere und schwere SARS-CoV-2-Infektionen verschrieben. Das niederländische Zentrum für Krankheitsbekämpfung empfahl 600 mg Chloroquinbase (6 Tabletten A-CQ 100 mg), gefolgt von 300 mg nach 12 Stunden am ersten Tag und dann 300 mg an den Tagen 2–5. Um den Anstieg von COVID-19 im Jahr 2020 zu bewältigen, veröffentlichte der Indian Council of Medical Research eine Empfehlung, HCQ (400 mg zweimal am ersten Tag, gefolgt von der 400-mg-Dosis einmal wöchentlich bis zu 3 bis 7 Wochen) als Prophylaxedosis zuzulassen jegliche Symptome auftreten, um das Infektionsrisiko zu verringern19. Es wurde berichtet, dass diese Art der oralen Dosierung aufgrund der sehr wirksamen Pharmakologie dieses Arzneimittels in vivo eine günstige pharmakologische Konzentration erreicht20,21,22.

Hydroxychloroquin (HCQ), ein Chloroquin-Derivat, erwies sich aufgrund seiner besseren Wasserlöslichkeit, geringen Toxizität und längeren Durchblutung als wirksamer5,8,18,23. Eine randomisierte klinische Studie von Pujol et al. zeigt die Sicherheit von HCQ in der niedrigen Dosierung24. Die Studie von Serrano et al. berichteten über die Effizienz von HCQ bei der Minimierung der viralen Infektiosität bis zu einem gewissen Grad25. In Anbetracht vieler ähnlicher pharmakologischer Erkenntnisse wurde dieses Medikament trotz der damit verbundenen Nebenwirkungen offensiv als prophylaktisches Mittel zur Kontrolle der SARS-CoV-2-Virusinfektion eingeführt. In den späten Monaten des Jahres 2020 wurde jedoch über einen vernachlässigbaren Einfluss von HCQ auf COVID-19 unter Verwendung von Calu-3-Zelllinien (Lungenadenokarzinom) und in vivo-Cynomolgus-Makaken berichtet11,26. Mehrere Studien haben Zweifel an der Wirkung von HCQ bei der Kontrolle der COVID-19-Infektion aufgedeckt27. Aufgrund des unbedeutenden Rückgangs der Sterblichkeit bei aufgenommenen COVID-19-Patienten hatte die WHO (Weltgesundheitsorganisation) auch die Unzulänglichkeit des HCQ bei der Behandlung der COVID-Erkrankung bekannt gegeben28. Die Unzufriedenheit mit der Wirksamkeit von HCQ aufgrund der Anzahl klinischer Studien sollte jedoch nicht als mangelnde Wirksamkeit dieses Arzneimittels als antivirales Breitbandmittel gewertet werden. Die Studie von Pandolfi et al. zu zellulären und variablen Zytokinspiegeln im BALF impliziert, dass die Anti-SARS-CoV-2-Wirkung des HCQ-Arzneimittels durch eine ultrastrukturelle Untersuchung von mit HCQ behandelten Patienten untersucht werden könnte29,30. Mehrere Mitte 2020 (März bis Oktober 2020) veröffentlichte Berichte unterstützten die positiven Auswirkungen von HCQ bei der Kontrolle der Infektion und Vermehrung des SARS-CoV-2-Virus4,16,31,32,33,34,35,36. Liu et al. haben in vitro gezeigt, dass HCQ den Transport von SARS-CoV-2 von frühen Endosomen zu Endolysosomen blockiert, was zu einer abnormal vergrößerten, signifikanteren Anzahl früher endosomaler Vesikel führt4. Eine Studie von Ruiz et al. (2021) zeigten das Vorhandensein einer pharmakologischen Konzentration von HCQ in der Flüssigkeit der Epithelauskleidung und der Lunge (höher als das Epithel) intubierter COVID-19-Patienten37. Allerdings wurde in vielen redaktionellen und ersten Berichten die Wirksamkeit von HCQ bei COVID-19 vermutet. Sie warnten vor den nachteiligen Auswirkungen einer wahllosen Verwendung, die durch Untersuchungen gestützt wurde, die die Unwirksamkeit des HCQ bei der Kontrolle oder Heilung von COVID-198,38,39,40,41,42 zeigten. Mehrere klinische Studien zeigten eine unbedeutende Wirkung von HCQ bei COVID-19-Patienten27. In Anbetracht des kontroversen Berichts über die Auswirkungen von HCQ auf COVID-19 unter In-vitro- und In-vivo-Bedingungen sollte diese Studie die Wirkung von HCQ auf die ultrastrukturelle Ebene der verschiedenen Zellen aus den bronchoalveolären Lavageflüssigkeiten (BALF) von Schwerinfizierten untersuchen und intubierte COVID-19-Patienten. Wir haben die Ultrastrukturen von Flimmerepithel, Typ-II-Pneumozyten, Alveolarmakrophagen, Neutrophilen und enukleierten Granulozyten aus dem BALF von leicht infizierten Nicht-ARDS-Patienten (intubiert aufgrund eines Traumas, HCQ−) und schweren ARDS-Patienten mit und ohne prophylaktischem HCQ verglichen .

Die Wirkung von prophylaktisch eingenommenem HCQ (vom gesunden Menschen vor der SARS-CoV-2-Infektion eingenommen, HCQ+) auf verschiedene Zellen aus dem BALF von Patienten mit schwerem ARDS (intubiert) wurde im Hinblick auf das Ausmaß der Infektion und ultrastrukturelle Veränderungen bewertet. Diese ultrastrukturellen Befunde wurden mit den schweren ARDS-Patienten verglichen, die HCQ nicht als prophylaktische Dosis eingenommen hatten (HCQ−). Für diese Studie wurden Patienten rekrutiert, die prophylaktisch HCQ eingenommen hatten und später ein SARS-CoV-2-induziertes ARDS entwickelten (Ergänzungstabellen S2 und S3). Alle ARDS-Patienten, denen nach der Infektion HCQ verabreicht wurde, wurden von der Studie ausgeschlossen. In dieser Studie wurden auch Patienten mit leichtem COVID-19 (Nicht-ARDS) rekrutiert, um die Auswirkungen von SARS-CoV-2-induziertem ARDS auf das Infektionsniveau und die ultrastrukturelle Modulation von BALF-Zellen zu bewerten. Diese Patienten wurden aufgrund eines Traumas intubiert und anschließend mit SARS-CoV-2 infiziert, wobei sie leichte klinische Symptome zeigten (Abb. 1). In dieser Studie wurden die Auswirkungen von HCQ auf die Ultrastruktur von Flimmerepithel, Typ-II-Pneumozyten, Makrophagen, Neutrophilen und entkernten Granulozyten untersucht.

Studiendesign zur Bewertung der Wirkung von prophylaktischem HCQ auf die Ultrastruktur verschiedener BALF-Zellen. Die BALF-Proben (32 Proben) wurden von den intubierten Patienten entnommen. Die Patienten wurden schließlich in die (a) Nicht-ARDS, HCQ−-Gruppe, (b) ARDS, HCQ−-Gruppe und (c) ARDS, HCQ+-Gruppe eingeteilt. Die milden COVID-19-Patienten (A) wurden aufgrund eines traumatischen Zustands (nicht aufgrund eines durch COVID-19 induzierten ARDS) intubiert, wurden jedoch durch RT-PCR als COVID-19-positiv befunden. Der BALF dieser Patienten wurde herangezogen, um die ultrastrukturellen Veränderungen zwischen den prophylaktischen HCQ+- und HCQ−-Gruppen zu untersuchen. Die drei Gruppen wurden ausgewählt, um die Wirkung des prophylaktischen HCQ auf die ultrastrukturellen Veränderungen im Flimmerepithel, Typ-2-Pneumozyten, Alveolarmakrophagen, Neutrophilen und nicht kernhaltigen zytoplasmatischen Fragmenten des BALF zu differenzieren. Die Anzahl der in dieser Studie rekrutierten Patienten wurde zusammen mit jeder Untergruppe angegeben.

Die Flimmerepithelzellen aus dem BALF von Patienten mit leichter Infektion (nicht-ARDS, HCQ−) zeigten eine intakte Zellstruktur, vakuolisiertes Zytoplasma mit einem dichten Kern (in der PAP-Bildgebung) und eine leichte zelluläre Infektion (Tabelle 1) unter Immunfluoreszenz (IF). Bildgebung (Abb. 2a). Die Oberflächenultrastruktur unter REM-Bildgebung zeigte viele virusähnliche Strukturen im Zell- und Zilienkörper (Abb. 2a). Die TEM-Bildgebung dieser Zellen zeigte gesunde Mitochondrien, viele basale Ziliarkomplexe (identifizierbare Merkmale für Flimmerzellen) und einige virusähnliche Strukturen (< 100 nm) auf der Plasmamembran und im peripheren Zytoplasma. Wir konnten in diesen Zellen keine virusähnlichen Partikel mit membrangebundenen Vesikeln finden (Abb. 2a). Diese Zellen von ARDS-Patienten ohne HCQ (HCQ−) zeigten ein stark vakuolisiertes Zytoplasma (was auf eine höhere Viruslast hinweist), mit einem dichten Zellkern unter dem Lichtmikroskop und einer höheren Immunfluoreszenz (hohe Infektion) (Abb. 2b). Ein Rasterelektronenmikroskop zeigte eine skelettartige Zellmorphologie mit vielen virusähnlichen Partikeln auf dem Körper und den Zilien der Zellen (Abb. 2b). TEM zeigte viele membrangebundene Vesikel mit körnigen virusähnlichen Partikeln (Pfeil). Viele Ziliarbasalkörperchen wurden als identifizierbare Merkmale von Ziliarzellen angesehen. Das Verschwinden der Plasmamembran und der geschwollenen Mitochondrien zeigte typische anfängliche apoptotische Merkmale, die auf eine höhere Virusinfektion hinweisen (Abb. 2b).

Flimmerepithel aus dem BALF eines intubierten COVID-19-Patienten. (a) Leichte Infektion (nicht-ARDS) HCQ−-Gruppe, (b) Schwere Infektion (ARDS) HCQ− und (c) Schwere Infektion (ARDS) mit prophylaktischer HCQ+-Gruppe. Das Flimmerepithel jeder Patientengruppe wurde mithilfe des PAP-Tests zur Identifizierung verschiedener Zellen in BALF (PAP) und Immunfluoreszenzbildgebung (zusammengeführtes Bild von DIC, DAPI und Alexa Flor 598) mithilfe des SARS-CoV-2-Virus-S-Proteins abgebildet Antikörper zur Bestimmung des Infektionsgrads mittels Fiji-Software (IF), Rasterelektronenmikroskopie zur Oberflächenabbildung von Viren und zur Visualisierung der Zellmorphologie (SEM) sowie zellulärer Ultrastrukturdetails mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Die Infektionsrate war in der Patientengruppe B am höchsten, gefolgt von den Gruppen A und C. Die Zilien waren in jeder Patientengruppe größtenteils intakt. Auf der Oberfläche und in der Zellmembran waren SARS-CoV-2-ähnliche Viruspartikel zu sehen (Pfeile). Der ultrastrukturelle Schaden war in der Patientengruppe b stärker ausgeprägt, gefolgt von den Gruppen c und a. N-Kern, C-Zilien, M-Mitochondrien, Pfeile SARS-CoV-2-Virus.

Die schweren ARDS-Patienten mit prophylaktischem HCQ (HCQ+) zeigten in der PAP-Bildgebung relativ gesunde Flimmerepithelzellen mit aktivem Zytoplasma und normalem Zellkern mit Nukleolus. Diese Zellen zeigten deutlich weniger Immunfluoreszenz, was auf eine milde Infektion in diesen Zellen hinweist. Die Oberflächenultrastruktur dieser Zellen zeigte ein gesundes Aussehen der Zellen mit sehr wenigen virusähnlichen Partikeln auf der Plasmamembran und den Zilien. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten gesunde Mitochondrien, dichtes Zytoplasma, exzentrische Kerne, vernachlässigbare membrangebundene Vesikel, viele virusähnliche Strukturen auf der Außenfläche der Plasmamembran und typische Vakuolen (Abb. 2c).

Typ-II-Pneumozyten von Patienten mit mildem COVID-19 (nicht-ARDS, HCQ−) zeigten einen dichten Kern mit vakuolisiertem Zytoplasma und milder Immunfluoreszenz. Die Oberflächen-Ultrastrukturen dieser Zellen waren jedoch mit typischen multiplen Mikrovilli-ähnlichen Morphologien bedeckt, die auf gesunde Zellen schließen lassen (Abb. 3a). Die TEM-Bildgebung zeigte den exzentrischen Kern mit vielen intakten Tensidkörnchen, Lipidkörpern, gesunden Mitochondrien und Restkörpern. Das Vorhandensein vieler Ferritinkörnchen weist auf den oxidativen Stresszustand der Zellen im milden Infektionsstadium hin. Auf der Plasmamembran dieser Zellen und in zytoplasmatischen Projektionen waren viele virusähnliche Partikel vorhanden (Abb. 3a). Allerdings veränderten Typ-II-Pneumozyten ihre Morphologie bei schweren ARDS-Erkrankungen (HCQ−). Es zeigt eine mäßige bis starke Immunfluoreszenz als Zeichen einer höheren Infektion (Tabelle 1). SEM zeigte die geschwollene Morphologie, den Verlust von Krümmungen, die Verringerung der Mikrovilli und die Vergrößerung der Zellgröße. Die TEM zeigte einen vollständig zerfallenen Zellkern, viele membrangebundene Vesikel, viele virusähnliche Partikel in den membrangebundenen Vesikeln, vakuolisiertes Zytoplasma, einen mageren Lipidkörper und viele freigesetzte Tensidkörnchen. Alle diese Ergebnisse weisen auf den hohen Stress und den anfänglichen apoptotischen Zustand dieser Zellen unter dem Einfluss hoher SARS-CoV-2-Infektionen hin (Abb. 3b).

Typ-II-Pneumozyten aus dem BALF intubierter COVID-19-Patienten. (a) Leichte Infektion (nicht-ARDS) HCQ−-Gruppe, (b) Schwere Infektion (ARDS) ohne HCQ (HCQ−) und (c) Schwere Infektion (ARDS) mit prophylaktischem HCQ (HCQ+)-Gruppe. Diese Zellen zeigten einen Membranvorsprung, ein charakteristisches Merkmal von Typ-II-Pneumozyten. Die Infektion war bei Patienten der Gruppe B am höchsten, gefolgt von den Gruppen A und C. Dies zeigt die Wirksamkeit von HCQ beim Schutz der Infektion in diesen Zellen vor dem SARS-CoV-2-Virus. Die REM-Bildgebung bestätigt das Vorhandensein einer Mikrovilli-ähnlichen Struktur zusammen mit virusähnlichen Partikeln auf der Oberfläche (Pfeil). Die Eigenschaften des Lamellenkörpers waren intakt und hatten in Gruppe C eine klare, unterscheidbare Morphologie; Diese wurden jedoch bei Patienten der Gruppe B freigesetzt. N Kern, M Mitochondrien, L Lipidkörper, LB Lamellenkörper, Pfeile SARS-CoV-2-Virus.

Allerdings zeigte der Patient in der prophylaktischen HCQ+-Gruppe in der optischen Mikroskop-Bildgebung gesündere Zellen und Zellkerne mit deutlich geringerer Immunfluoreszenz. Eine geringfügige Infektion kann auf die geringere Internalisierung und Vermehrung des SARS-CoV-2 unter dem Einfluss von HCQ zurückzuführen sein. Diese Zellen der prophylaktischen HCQ+-Patienten zeigten in der REM-Bildgebung eine normale Oberflächenmorphologie. Allerdings zeigten einige Zellen in der TEM-Bildgebung eine Nekrose mit reichlich Tensidkörnchen (Abb. 3c). Viele Zellen zeigten eine intakte Morphologie mit einem beanspruchten Zellkern, aber intakten Tensidkörnern.

Um die ultrastrukturellen Veränderungen in Alveolarmakrophagen bei leichtem, schwerem ARDS (HCQ−) und prophylaktischem HCQ+ zu identifizieren und zu vergleichen, wurden Patienten mit PAP, IF, SEM und TEM abgebildet, um die Anzahl der Oberflächenprojektionen, die Ultrastruktur und das Zytoplasma sowie das Vorhandensein von zu beobachten virusähnliche Partikel. Die Makrophagen von Patienten mit leichter Infektion zeigten ein relativ vaskuläres Zytoplasma und einen dichten Kern bei mittelschweren bis schweren Infektionen (Tabelle 1). Die Oberflächenmorphologie mittels REM-Bildgebung zeigte eine typische raue Oberfläche mit sehr wenigen virusähnlichen Strukturen. Die TEM ergab einen hufeisenförmigen Kern mit peripherem Euchromatin, Nukleolus, dichtem Zytoplasma, mehreren Phagosomen und einer geringeren zytoplasmatischen Projektion, was auf gesunde Zellen hinweist (Abb. 4a). Die ARDS-Patienten (HCQ−) zeigten proliferative alveoläre Makrophagenzellen mit sehr hoher Immunfluoreszenz. Die Oberflächenmorphologie zeigte den typischen hyperaktiven Makrophagen mit zahlreichen Viren auf der Oberfläche. Diese Zellen zeigten einen anfänglichen apoptotischen Kern mit großen Phagosomen, die mit virusähnlichen Partikeln gefüllt waren (Pfeil). Dies gibt den stark proliferativen Zustand dieser Zellen unter dem Einfluss von Zytokinstürmen an (Abb. 4b). Dieser Makrophage der prophylaktischen HCQ+-Patienten zeigte eine mäßige Infektion und eine proliferative Oberflächenmorphologie. Allerdings zeigte die TEM einen gesunden Zellkern und Zellen mit reichlich gefüllten Phagosomen. Die ultrastrukturelle Veränderung ähnelte der der HCQ−-Gruppe (Abb. 4c).

Makrophagen/Monozyten aus dem BALF intubierter COVID-19-Patienten. (a) Gruppe mit leichter Infektion (nicht-ARDS) und HCQ−, (b) Gruppe mit schwerer Infektion (ARDS) ohne HCQ (HCQ−) und (c) Gruppe mit schwerer Infektion (ARDS) mit prophylaktischem HCQ (HCQ+). Die IF-Studie zeigte bei allen Patientengruppen eine schwere Infektion, was auf die unwirksame Rolle von HCQ im Alveolarmakrophagen hinweist. SEM-Bilder zeigten mehrere virusähnliche Strukturen auf der Zelloberfläche (Pfeile) mit ähnlicher Oberflächenmorphologie bei ARDS-Patienten (b, c). TEM-Bilder zeigen Phagosomen auf dem Zellzytoplasma mit vielen Viren (Pfeile). In den ARDS-Patientengruppen kam es zu ähnlichen ultrastrukturellen Schäden (b, c). Die Nicht-ARDS-Gruppe (a) zeigte auch bei höherer Infektion eine intakte zelluläre Ultrastruktur. N-Kern, M Mitochondrien, RB-Restkörper, P-Phagosom, Pfeile SARS-CoV-2-Virus.

Neutrophile aus der BALF-Probe leicht infektiöser Patienten zeigten vaskuläres Zytoplasma mit einem mehrlappigen Kern mit milder Immunfluoreszenz. Die Oberflächenmorphologie zeigte in der REM-Bildgebung einen geschrumpften Zellkörper. Ihre Kerne zeigten stressähnliche Zustände mit einer peripheren Ansammlung von Heterochromatin und zentral lokalisiertem Euchromatin. Das Vorhandensein mehrerer und verstreuter gesunder Mitochondrien mit anderen zytoplasmatischen Organellen bestätigt die aktivierten Neutrophilen ohne extrazelluläre Neutrophilenfallen (NETs) (Abb. 5a). Allerdings bestätigten dichte Kerne und verdichtete Zytoplasmen unter dem Lichtmikroskop von Patienten mit schwerem ARDS den stark proliferativen Zustand dieser Zellen mit vielen NETs-ähnlichen Strukturen. Diese Zellen zeigten auch eine relativ höhere Immunfluoreszenz, was auf eine schwere Infektion hindeutet. Die Oberflächenultrastruktur zeigte viele NETs-ähnliche Strukturen, die auf die hohen Stressbedingungen in diesen Zellen hinweisen. TEM zeigte einen heterochromatischeren Kern, was auf den anfänglichen apoptotischen Zustand mit vielen Vakuolen mit virusähnlichen Strukturen und vielen NETs hinweist. Die wenigen Mitochondrien mit vielen Viren auf der Zelloberfläche bestätigen den anfänglichen apoptotischen Zustand, der durch eine SARS-CoV2-Virusinfektion verursacht wird (Abb. 5b).

Neutrophile aus dem BALF eines intubierten COVID-19-Patienten. (a) HCQ−-Gruppe mit leichter Infektion (nicht-ARDS), (b) Patienten mit schwerer Infektion (ARDS) ohne HCQ (HCQ−) und (c) Gruppe mit schwerer Infektion (ARDS) mit prophylaktischem HCQ (HCQ+). In allen Untergruppen der Patienten wurde ein mehrlappiger zerfallender Kern mit externen NETs beobachtet. Der Infektionsgrad (IF) war in den ARDS-Gruppen (b) und (c) signifikant und in Gruppe (a) mild. HCQ hat keine Auswirkungen auf neutrophile Zellen zur Kontrolle von Infektionen und zur Virusinternalisierung. REM-Bilder zeigten mehrere virusähnliche Strukturen auf der Zelloberfläche. TEM-Bilder zeigen Phagosomen auf dem Zellzytoplasma mit vielen Viren (Pfeile). HCQ zeigte keine schützende Wirkung auf die Infektion dieser Zellen. N-Kern, M-Mitochondrien, RB-Restkörper, P-Phagosom, Nt-Neutrophilen-Extrazellulärfallen, Pfeile SARS-CoV-2-Virus.

Neutrophile aus der Gruppe der Patienten mit schwerem ARDS und prophylaktisch eingenommenem HCQ+ zeigten eine bessere Zell- und Kernmorphologie bei relativ moderaten Infektionen, wie durch die Immunfluoreszenz angezeigt (Tabelle 1). Die Oberflächenmorphologie zeigte jedoch viele kleine NETs-ähnliche Projektionen. Die Projektionen dieser NETs wurden auch in der Transmissionselektronenmikroskop-Aufnahme mit zahlreichen Vakuolen, die unreife virusähnliche Partikel, Heterochromatin-reiche Kerne und viele kleine Mitochondrien enthielten, geschätzt. Diese Neutrophilen zeigten einen ähnlichen proliferativen Zustand wie die HCQ−-Gruppe (Abb. 5c).

BALF enthält viele entkernte Zellen, die aus den Granulozyten des Blutes nach dem Abbau des Zellkerns unter dem Einfluss einer höheren Infektion mit SARS-CoV-2 stammen. Diese zytoplasmatischen Strukturen zeigten eine intensive Fluoreszenz, was auf eine hohe Viruslast schließen lässt. Bei den Patienten mit leichter Infektion konnten wir keine entkernten Granulozyten finden. Die ARDS-Patienten zeigten eine starke Immunfluoreszenz mit NET-ähnlichen Strukturen auf der Oberfläche. TEM zeigte zahlreiche Viren in den membrangebundenen Vesikeln ohne Zellkern. Wir haben diese Zellen vollständig geschnitten und abgebildet, konnten jedoch mit der TEM das Vorhandensein eines Zellkerns nicht lokalisieren. Einige periphere Vakuolen zeigten die Freisetzung des Virus auf der Zelloberfläche (Abb. 6a). Die Patienten mit prophylaktischem HCQ zeigten körniges Zytoplasma und eine mittelschwere bis schwere Infektion, erkennbar an einer hohen Immunfluoreszenz. Die Oberflächenmorphologie war eine typische abgerundete Struktur mit vielen reifen virusähnlichen Partikeln. TEM zeigte exzentrisch winzige Fragmente leichter Kernreste mit zahlreichen Vesikeln, Phagosomen und kleinen Viruspartikeln, was das SARS-CoV-2-Virus bestätigte. Die Zellen der HCQ+-Gruppe zeigten eine sehr hohe Phagozytose des reifen SARS-CoV-2-Virus (Abb. 6b).

Entkernte Granulozyten aus dem BALF eines intubierten COVID-19-Patienten. (a) ARDS-Patienten ohne HCQ (HCQ−) und (b) ARDS mit prophylaktischem HCQ (HCQ+) Gruppe. Im BALF wurden viele kernlose Zellen beobachtet, die im Vergleich zu anderen Zellen den höchsten Grad an SARS-CoV-2-Infektionen aufwiesen. Diese Zellen wiesen einen Granulozyten-Ursprung auf und waren CD15-positiv. Die TEM-Bildgebung zeigte in beiden Gruppen stark vakuolisierte Phagosomen. Allerdings zeigten die mit HCQ behandelten Gruppenzellen vollständig gefüllte Phagosomen mit reifen Viren. Pfeile SARS-CoV-2-Virus.

In dieser Vergleichsstudie wurden die Auswirkungen von HCQ auf verschiedene Zellen im BALF von COVID-19-Patienten im Hinblick auf das Ausmaß der SARS-CoV-2-Virusinfektion, die Auswirkungen auf die Zelloberfläche und andere Zellorganellen (Ultrastruktur) bewertet durch Licht- und Elektronenmikroskopie. Diese Studie wurde an BALF-Proben von COVID-19-positiven intubierten Patienten durchgeführt, um die Wirkung von HCQ+ gegenüber HCQ− durch ultrastrukturellen Vergleich und Infektionsgrad zu verstehen. BALF erwies sich als wertvolle Probe für die Untersuchung der Verbreitung des SARS-CoV-2-Virus und der Auswirkungen von prophylaktischem HCQ auf COVID-19. Die elektronenmikroskopische Untersuchung der SARS-CoV-2-infizierten Zellen wurde durchgeführt, um den Einfluss von HCQ auf die ultrastrukturellen Veränderungen und die Virusausbreitung bei Patienten mit schwerem ARDS zu bewerten. Flimmerepithelzellen von prophylaktischen HCQ+-Patienten zeigten eine signifikant geringere Infektion (Immunfluoreszenz) und einen gesunden Zellkern/Zytoplasma als die HCQ−-Gruppe (Abb. 2). Dies legt fest, dass prophylaktisches HCQ eine präventive Rolle bei der Internalisierung des SARS-CoV-2-Virus im Flimmerepithel spielt. Relativ weniger Virionen in charakteristischen membrangebundenen Vesikeln, Virusauskleidung auf der Zelloberfläche und eine geringere Anzahl von Doppelmembranvesikeln bei HCQ+-Patienten liefern klare Beweise für die Verringerung der SARS-CoV-2-Infektion (Abb. 2). Dies deutet auch auf eine Verringerung der Replikation viraler Partikel im Flimmerepithel der HCQ+-Gruppe während der Spätphase der Infektion hin. Mit SARS-CoV-2 infizierte Zellen zeigen meist eine unregelmäßige Morphologie mit Ausbreitung vom Rand zur Mitte der Zellschicht. Diese infizierten Zellen zeigten auch ein allmähliches Auftreten kleiner Aggregate und eine Zunahme interstitieller Partikel. Die erkrankten Zellen wurden abgerundet, verdichtet, lösten sich ab oder verschmolzen43. In unserer Studie zeigten die HCQ+-Zellen vergleichsweise geringere Veränderungen, was indirekt den Einfluss von HCQ auf die Infektionskontrolle in diesen Zellen auf ultrastruktureller Ebene beweist (Abb. 2).

Pneumozytenzellen vom Typ II setzen Tenside frei, die eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr und der Atemwegsregeneration bei Lungenverletzungen spielen44. Diese Zellen aus der HCQ+-Gruppe zeigten ein relativ gesundes Zytoplasma mit geringerer Infektion als milde und ARDS-Patienten ohne prophylaktisches HCQ (HCQ−-Gruppe). Dies liefert einen direkten Beweis für die Infektionskontrolle durch das prophylaktische HCQ+ in diesen Zellen. Es wurde bereits berichtet, dass Pneumozyten vom Typ II in der prophylaktischen Patientengruppe einen höheren HCQ-Spiegel aufweisen als alle anderen Zellen der Lunge37. Bei diesen Zellen wurde unter Elektronenmikroskopie im Vergleich zu Patienten mit schwerem ARDS eine deutlich geringere Anzahl charakteristischer hemilamellarer Körper (entstanden aufgrund einer Virusinfektion) beobachtet (Abb. 3). Diese Organellen waren im deutlich erweiterten rauen endoplasmatischen Retikulum und in den Vesikeln mit einer ungleichen Anzahl reifer Virionen gefüllt. Die Viruspartikel in diesen Zellen wurden als kreisförmige Objekte in den Vesikeln beobachtet, bei denen es sich um polyvakuoläre Körper oder autophagische Vesikel handeln kann, die Partikel umhüllten. Die TEM-Bildgebung dieser Zellen zeigte, dass SARS-CoV-2 durch Membranfusion in Zellen internalisiert und in Vesikeln gereift ist (Abb. 3).

Die histopathologische Analyse des BALF von ARDS-Patienten ergab in allen Patientengruppen fibroproliferative Reaktionen von Alveolarmakrophagen mit diffuser Alveolarschädigung. Die vernachlässigbaren Veränderungen der Ultrastruktur in Alveolarmakrophagen bei Patienten mit leichter Infektion können auf ein niedriges Infektionsniveau zurückzuführen sein. Die Ultrastrukturen zeigten, dass diese Makrophagen nicht aktiviert waren. Es wurde berichtet, dass Monozyten und die Aktivierung von Makrophagen die Hauptursache für das ARDS-ähnliche Entzündungssyndrom sind, da sie zwei- bis dreimal mehr entzündliche Zytokine exprimieren45,46. Bei Patienten mit schwerem ARDS weist das schaumige Aussehen jedoch auf einen hyperaktiven und apoptotischen Makrophagen hin. Dies ist auf unterschiedliche Vesikelgrößen und die Ansammlung von Fibrin in der Nähe der Zellmembran zurückzuführen. Eine ähnliche Morphologie dieser Makrophagen in der HCQ+-Gruppe zeigte keinen Einfluss des HCQ auf die zelluläre Ultrastruktur (Abb. 4).

Die Virusreplikation innerhalb der Zellen löst eine Zellschädigung aus, die durch die Freisetzung von Entzündungsmediatoren zur zweiten Linie der angeborenen Reaktion führt. Aufgrund einer Entzündung strömen zirkulierende Neutrophile und Monozyten zum Infektionsort, wo sie mit der Phagozytose des eindringenden Virus beginnen. Die normale zelluläre Ultrastruktur der Neutrophilen der Patientengruppe mit leichter Infektion deutete auf eine geringere Entzündung hin. Allerdings wurde in der Gruppe der schwer erkrankten und HCQ+-Patienten ein offensichtlicher zytopathischer Effekt beobachtet, der keinen infektionsschützenden Effekt von HCQ auf diese Zellen zeigte. Das vakuoläre Zytoplasma mit zahlreichen virusähnlichen Strukturen und NETs waren Indikatoren für aktivierte Neutrophile (Abb. 5).

Mehrere kernlose Zellen oder deren Fragmente mit einem sehr hohen Infektionsgrad bei Patienten mit schwerem ARDS mit und ohne HCQ weisen auf die vernachlässigbare Auswirkung von HCQs auf diese Zellen hin. Diese Zellen haben einen Granulozyten identifiziert, da sie in der Immunhistochemie positiv auf CD 15 waren47. Die phagozytischen Vesikel waren mit reifen Viren gefüllt, was darauf hindeutet, dass HCQs die phagozytische Aktivität von Granulozyten erhöhen können (Abb. 6).

Diese Studie beleuchtete das Ausmaß der SARS-CoV-2-Infektion und der ultrastrukturellen Veränderung in der prophylaktischen HCQ+-Gruppe im Vergleich zur HCQ−-Gruppe des Flimmerepithels, der Typ-II-Pneumozyten, der Alveolarmakrophagen, der Neutrophilen und der anukleierten Granulozyten einzeln. Wir fanden heraus, dass die signifikante antivirale Aktivität von HCQ eher eine schützende als eine degenerierende Wirkung auf das Flimmerepithel und Typ-II-Pneumozyten hat, bei denen ein niedriges Infektionsniveau und eine relativ intakte zelluläre Ultrastruktur beobachtet wurden. Die Ultrastruktur der Alveolarmakrophagen und Neutrophilen war bei ARDS-Patienten sowohl der HCQ+- als auch der HCQ−-Gruppe degeneriert. Enukleierte Granulozytenfragmente zeigten jedoch eine höhere Tendenz zur Phagozytose des reifen SARS-COV-2-Virus in der HCQ+-Gruppe.

BSA und Ethanol wurden von Himedia bezogen. Triton X-100 wurde von Fisher Scientific bezogen. Osmiumtetroxid wurde von Ted Pella, USA, bezogen. Uranylacetat stammte von TAAB, Großbritannien, und Bleicitrat von Ladd. Polyklonaler Anti-SARS-CoV-2-spezifischer Primärantikörper (Kat.-Nr. ab275759) und Alexa-Fluor-594-konjugierter Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Kat.-Nr. ab150080) wurden von Abcam, Plc, Großbritannien, bezogen. Karnovskys Fixiermittel (0,5 % Glutaraldehyd + 2,0 % Paraformaldehyd), Hämatoxylin, Eosin, Orange G, Scotts Wasser, Xylol, DPX, PBS, Poly-L-Lysin, Epoxid-Einbettungskit und DAPI wurden von Sigma Chemical Company, MO, USA, gekauft .

BALF von leicht und schwer mit SARS-CoV-2 infizierten (COVID-19-positiv) und intubierten Patienten auf der Intensivstation wurden nach Einholung der Einverständniserklärung aller Teilnehmer oder Patientenvertreter gesammelt. Die Studie wurde vom Institutional Ethics Committee (IEC) des All India Institute of Medical Sciences New Delhi, Indien, genehmigt (Ref. Nr. IEC-307/27.04.2020, RP-10/202). Wir bestätigen, dass alle Experimente in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt wurden.

BALF-Proben wurden von intubierten SARS-CoV-2-positiven Patienten auf der COVID-19-Intensivstation (ICU) des AIIMS in Neu-Delhi entnommen. Alle Proben wurden zwischen dem 3. Oktober 2020 und dem 31. Januar 2021 gesammelt (Ergänzungstabelle S1). Die Patienten wurden in drei Gruppen eingeteilt: (A) Patienten mit leichter Infektion ohne ARDS (Nicht-ARDS, HCQ−, 11 Patienten), (B) schwere Infektion mit ARDS ohne prophylaktisches HCQS (ARDS, HCQ−, 15 Patienten), und (C) Patienten mit schwerem ARDS, die HCQS vor der SARS-CoV-2-Infektion als prophylaktische Dosis eingenommen hatten (ARDS, HCQ+, 06 Patienten) (Abb. 1). Zur Bestätigung der COVID-19-Infektion wurde bei allen in die Studie rekrutierten Patienten ein RT-PCR-Test durchgeführt. Die Patienten, die nach Auftreten der COVID-19-Symptome HCQ eingenommen hatten, wurden von der Studie ausgeschlossen. Die ARDS-Patienten wurden aufgrund von Hypoxämie (SpO2 < 90 %), hohem Sauerstoffbedarf (Flussrate 20–25 l/min) und sich verschlimmernden Atemproblemen intubiert.

Das BALF (15–20 ml) wurde hauptsächlich in frisch zubereiteten 20 ml 2X Karnovsky-Lösung (endgültig 5 % Glutaraldehyd + 4,0 % Formaldehyd) in 0,2 M Phosphatpuffer fixiert. Die Oberfläche der Probenfläschchen wurde mit einer Alkohol-/Seifenlösung durch Inkubation für zwei Stunden bei Raumtemperatur sterilisiert und bei 4 °C in einem für COVID-19 vorgesehenen Kühlschrank gelagert. Die Krankenakten aller Patienten wurden von einem diensthabenden Arzt überprüft und abgeglichen.

Nach der primären Fixierung wurde die BALF-Lösung zehnmal mit 0,1 M NaCl-Lösung verdünnt und durch ein Zellsieb aus Nylonnetz mit einer Pore von 100 µm gesiebt. Das Filtrat wurde 3 Minuten lang bei 2500 U/min in einem Ausschwingbecher zentrifugiert. Die Zellpellets wurden 2–3 Mal 10 Minuten lang mit PBS-Lösung gewaschen, um den überschüssigen Schleim zu entfernen. Der Zellinhalt wurde durch 3-minütige Zentrifugation bei 1200 × g angereichert und erneut im primären Fixiermittel A (0,5 % Glutaraldehyd und 2,0 % Paraformaldehyd in 0,1 M PB-Puffer) resuspendiert. Diese Proben wurden für die PAP-Färbung, Immunfluoreszenz (IF), Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie (REM, TEM) verarbeitet.

BALF wurde dreimal mit 0,1 M Phosphatpuffer gewaschen und Ausstriche wurden unter Verwendung von 10 µL Probe auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträgern hergestellt und bei Raumtemperatur (RT) luftgetrocknet. Die Abstriche wurden mit PBST (0,1 % Triton 1:500) für vier Stunden in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen mit PBS wurde der Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper (Alexa Fluor-594-konjugierter Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, Abcam, Kat.-Nr.-150080; Verdünnung 1:500;) für 1 Stunde bei RT in der Dunkelkammer hinzugefügt. Die Abstriche wurden mit Phosphatpuffer gewaschen und 5 Minuten lang DAPI (1 μg/ml) zugegeben. Überschüssiges DAPI wurde mit PBS gewaschen und die Ausstriche wurden mit 90 % Glycerin aufgetragen. Die Fluoreszenzbildgebung wurde mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Leica SP8 Deutschland) durchgeführt.

Für die SEM wurden die angereicherten und primär fixierten Zellkomponenten von BALF osmiert, mit Ethanol dehydriert, am kritischen Punkt getrocknet (E-3100, Quorum Tech) und auf doppelseitigem Klebeband auf den Aluminiumstummeln befestigt. Diese Stubs wurden mit einem goldbasierten Sputtercoater (HHV BT-150) 180 s lang sputterbeschichtet. Elektronenmikroskopische Aufnahmen wurden mit einem EVO18-REM (Zeiss, Deutschland) erstellt, das mit einer Beschleunigungsspannung von 20 kV, einem durchschnittlichen Arbeitsabstand zwischen 8 und 10 mm mit SE-Detektor und Vergrößerungen im Bereich von 5000 × bis 30.000 × betrieben wurde.

Um die Proben für die TEM-Bildgebung vorzubereiten, wurden angereicherte zelluläre Bestandteile von BALF hauptsächlich mit 2,5 % Glutaraldehyd + 2,0 % Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) fixiert. Die fixierten Zellpellets wurden mit 0,1 M PB (pH 7,4) gewaschen und mit 1 % Osmiumtetroxid in 0,1 M PB (pH 7,4) eine Stunde lang (sekundäre Fixierung) bei 4 °C nachfixiert. Die Pellets wurden zwei Stunden lang mit destilliertem Wasser gewaschen und die Gesamtfärbung erfolgte mit 2 % Uranylacetat in 50 % Ethanol. Diese Proben wurden erneut mit destilliertem Wasser gewaschen und in einer Ethanolreihe (50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 %) dehydriert. Diese Pellets wurden mit Toluol/Harz infiltriert und schließlich in Araldite CY212-Harz eingebettet. Die Blöcke wurden 48 Stunden lang bei 65 °C polymerisiert. Die Harzblöcke wurden zugeschnitten und 70 nm dünne Schnitte wurden mit dem Ultramikrotom UC7 (Leica) hergestellt. Die Schnitte wurden auf Gitter montiert und mit 5 % Uranylacetat und 5 % Bleicitrat gefärbt. Die Zellen wurden mit dem Transmissionselektronenmikroskop Talos F200 (Thermo Fisher Scientific) unter Verwendung eines bei 200 kV betriebenen FEG-Filaments abgebildet.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze (mikroskopische Bilder von PAP, IF, SEM und TEM) sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken allen Angehörigen der Patienten für die Erlaubnis, BALF von den Patienten abzuholen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des IUSSTF Indo-US Virtual Network für das COVID-19-Programm (IUSSTF/VN-COVID/007/2020) unterstützt. Wir danken für weitere Finanzierung durch DBT (BT/INF/22/SP44285/2021), ICMR, SERB und AIIMS intramurale Zuschüsse. SAIF-AIIMS New Delhi ist als Bildgebungseinrichtung für SEM und TEM anerkannt. Die Einrichtung für konfokale Mikroskope des DST-FIST wird auch für ihre Einrichtung zur Immunfluoreszenz gewürdigt. Wir dankten Dr. Kapil Soni und Prof. Anjan Trikha für die Erlaubnis, die BALF-Proben von den jeweiligen Stationen zu sammeln.

IUSSTF Indo-US Virtual Network für das COVID-19-Programm (IUSSTF/VN-COVID/007/2020) und DBT SAHAJ (BT/INF/22/SP44285/2021).

Elektronenmikroskopische Einrichtung, Abteilung für Anatomie, All India Institute of Medical Sciences, Neu-Delhi, Delhi, 110029, Indien

Shikha Chaudhary, Arti Joshi, Kishore Sesham, Preeti Rai, Tapas Chandra Nag und Subhash Chandra Yadav

Abteilung für Anästhesiologie, Schmerzmedizin und Intensivpflege, All India Institute of Medical Sciences, Neu-Delhi, Delhi, 110029, Indien

Shailendra Kumar

Abteilung für Pathologie, All India Institute of Medical Sciences, Neu-Delhi, Delhi, 110029, Indien

Asit Ranjan Mridha

Abteilung für Medizin, All India Institute of Medical Sciences, Neu-Delhi, Delhi, 110029, Indien

Upendra Baitha

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SC führte die Experimente zur Probenverarbeitung, Standardisierung der PAP- und IF-Bildgebung, Elektronenmikroskopie, Interpretation der Daten, Verwaltung klinischer Aufzeichnungen und Erstellung der Mikroskopiezahlen durch. PR führte die Immunfluoreszenz-Bildgebung durch, zeichnete die klinischen Daten auf und unterstützte SC bei elektronenmikroskopischen Experimenten. AJ führte die PAP-Bildgebung durch. KS sammelte die Probe auf den Intensivstationen. SK war an der Gestaltung der Studie und der Standardisierung der Probenentnahmestrategien beteiligt. ARM und TCN halfen bei der Interpretation der Ergebnisse, der Bilder und der Korrektur von Manuskripten. ARM und UB halfen auch bei der Korrektur des Manuskripts. SCY entwarf die Studie, führte und überwachte Experimente mit COVID-19-Patienten, analysierte die Daten, generierte die Zahlen, verfasste das Manuskript und leitete das Projekt. Alle Autoren haben den endgültigen Entwurf dieses Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Subhash Chandra Yadav.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chaudhary, S., Joshi, A., Sesham, K. et al. Einfluss von prophylaktischem Hydroxychloroquin auf ultrastrukturelle Beeinträchtigungen und zelluläre SARS-CoV-2-Infektionen in verschiedenen Zellen bronchoalveolärer Lavageflüssigkeiten von COVID-19-Patienten. Sci Rep 13, 12733 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39941-6

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Eingegangen: 18. November 2022

Angenommen: 02. August 2023

Veröffentlicht: 05. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39941-6

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Einfluss von prophylaktischem Hydroxychloroquin auf ultrastrukturelle Beeinträchtigungen und zelluläres SARS