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Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4658 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Materialbasierte Taktiken haben große Aufmerksamkeit auf sich gezogen, um die funktionelle Evolution von Organismen voranzutreiben. Mit dem Ziel, steuerbare biokünstliche Organismen zum Abfangen pathogener, durch Wasser übertragener Viren zu entwickeln, entwickeln wir Paramecium caudatum (Para), einzellige Mikroorganismen, mit einem halbkünstlichen und spezifischen virusabfangenden Organell (VSO). Magnetische Fe3O4-Nanopartikel, die mit einem Virus-Capture-Antikörper (MNPs@Ab) modifiziert sind, werden während der Nahrungsaufnahme in die Vakuolen von Para integriert, um VSOs zu produzieren, die in Para verbleiben, ohne ihre Schwimmfähigkeit zu beeinträchtigen. Im Vergleich zu natürlichem Para, das keine Einfangspezifität aufweist und eine ineffiziente Inaktivierung zeigt, sammelt das von VSO entwickelte Para (E-Para) gezielt durch Wasser übertragene Viren und hält sie in den VSOs fest, wo die eingefangenen Viren vollständig deaktiviert werden, da die Peroxidase-ähnlichen Nano- Fe3O4 produziert in der sauren Umgebung von VSO virustötende Hydroxylradikale (•OH). Nach der Behandlung kann magnetisiertes E-Para problemlos recycelt und wiederverwendet werden, wodurch eine weitere Kontamination vermieden wird. Auf Materialien basierende künstliche Organellen verwandeln natürliches Para in einen lebenden Virenfänger und erleichtern so die Beseitigung wasserbasierter Viren ohne zusätzlichen Energieverbrauch.

Die Integration funktioneller Nanomaterialien und Organismen kann die funktionelle Entwicklung lebender Organismen mit adressierbarer biologischer Reaktionsfähigkeit und breiten Anwendungsaussichten1,2,3 fördern und erregt daher große Aufmerksamkeit in der Biomedizin4,5,6, der Herstellung von Mikrorobotern7,8,9 und der Energieumwandlung10 ,11 und Umweltwissenschaften12. Interessanterweise sind magnetotaktische Bakterien (MTB) typische Beispiele für Organismen, die ihre eigenen biologischen Funktionen mithilfe magnetischer Materialien regulieren13,14. MTB verfügen über Organellen, die als Magnetosomen bekannt sind und magnetische Nanopartikel enthalten, die von Lipiddoppelschichten umhüllt sind, die eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Magnetotaxis und dem Überleben des MTB spielen15,16. Bemerkenswert ist, dass das Kompartiment für das Magnetosom als potenzielles Tor für die Differenzierung des pH-Werts oder des Redoxpotentials zwischen dem Vesikel und der zellulären Umgebung fungiert17. Inspiriert durch MTB sind dynamische subzelluläre Kompartimente günstig für die Materialintegration, da sie die biologische Clearance abschirmen und gleichzeitig die relative Stabilität in der intrazellulären Umgebung aufrechterhalten können, was ein Schlüsselelement für die Modifikation des Organismus darstellt. Obwohl die materialbasierte Evolution von Organismen breites interdisziplinäres Interesse geweckt hat, werden die Strategien, die zur Herstellung der oben genannten materialintegrierten Organellen erforderlich sind, nach wie vor unzureichend genutzt.

Protisten sind die wichtigsten Virenfresser in Gewässern. Sie spielen eine wesentliche Rolle bei der wirksamen Kontrolle biologischer Abwässer18,19. Es wurden Versuche unternommen, Ciliaten zur Lösung von Wasserumweltproblemen einzusetzen20. Allerdings hängt die Anfälligkeit des Virus für die Beweidung durch Protisten stark von der Art und der Hydrophobie des Virus ab21. Obwohl der Einsatz von Protisten zur Behandlung von durch Wasser übertragenen Viren vielversprechend ist, sind ihre Entfernungsraten aufgrund fehlender mechanistischer Erkenntnisse um weniger als vier Größenordnungen begrenzt. Noch wichtiger ist, dass Protisten aufgrund der geringen Effizienz bei der Inaktivierung von Viren auch als Virusreservoir fungieren können, um die aufgenommenen Viren vor der Inaktivierungsbehandlung zu schützen22, was das Übertragungsrisiko von durch Wasser übertragenen Viren erhöht. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation kommt es trotz der jahrzehntelangen Entwicklung von Membranfiltrations- und Desinfektionstechnologien23 wie Umkehrosmose (RO), Ultrafiltration (UF), Nanofiltration (NF) und Chlorierung weltweit immer noch zu durch Viren verursachten Krankheiten. UV/Ozon (Ergänzungstabelle 1)24,25,26,27. Im Gegensatz zu herkömmlichen Techniken schlagen wir die Entwicklung einer bioartifiziellen virusabfangenden Organelle (VSO) vor, um Protisten die Fähigkeit zu verleihen, durch Wasser übertragene Viren gezielt einzufangen und zu eliminieren.

Wir verwenden Paramecium caudatum (Para), einen einzelligen, frei lebenden Ciliaten, als Modell, da Para sich vermehren, in viskosem Wasser schwimmen und Chlorviren grasen und als Nahrung konsumieren kann, während gleichzeitig die Produktion toxischer Nebenprodukte und hohe Energiekosten vermieden werden28, 29. Obwohl in einigen Studien berichtet wurde, dass Para in der Lage ist, bestimmte Arten von Viren aufzunehmen, ist die Fähigkeit zur Viruseinfang- und Viruseliminierung virusspezifisch und weniger wirksam22,28,29. Daher ist es unmöglich, Para oder Protisten direkt als Strategie zur Virenentfernung zu nutzen. Hier machen wir uns den Nahrungsaufnahmeprozess von Para30 zunutze, um den Aufbau künstlicher subzellulärer Organellen innerhalb des Para31,32 zu ermöglichen. Dementsprechend entwerfen wir ein magnetisches Fe3O4-Nanopartikel, das mit einem auf Viren gerichteten Antikörper modifiziert ist (MNPs@Ab, Abb. 1a) und integrieren MNPs@Ab über einen Feed-Prozess in Vakuolen, um eine spezifische, auf Viren abzielende und abfangende Organelle einzuführen (VSO, Abb. 1b). ). Die erhaltenen VSO-Module hatten eine lange Lebensdauer im konstruierten Para (E-Para) und ermöglichten die Viruseinfangung durch das Vorhandensein spezifischer Antikörper in VSOs durch die Fusion virusbeladener Vakuolen und VSOs (Abb. 1c). In VSOs stimulierte die saure Umgebung, die eine große Menge Wasserstoffperoxid (H2O2) enthielt, die Peroxidase-ähnliche Aktivität von MNPs33 und erzeugte über die Fenton-Reaktion34 Hydroxylradikale, was zu einer effizienten Deaktivierung von Viren führte. Nach dem Einfangen der Viren wurden die E-Para effizient mit einem externen Magneten gesammelt, um die Umweltverschmutzung zu minimieren (Abb. 1d). Um ein vielseitiges VSO zur Entfernung generischer Viren zu erhalten, wurden Antikörper auf den MNPs@Ab durch virusabfangende Sialinsäure ersetzt, die gleichzeitig drei verschiedene Arten von Viren im Wasser abtreift, was die Universalität dieser Strategie widerspiegelt. Der E-Para fängt pathogene Viren aus Umweltwasser ab und stellt einen vielversprechenden Bioroboter zur Bekämpfung von durch Wasser übertragenen Krankheiten und zur Reinigung von Umweltwasser dar. Unsere Ergebnisse liefern ein neues Konzept zur Förderung der funktionellen Evolution lebender Organismen mit halbkünstlichen Organellen, die aus funktionalen Nanomaterialien hergestellt werden.

a Vorbereitung von MNPs@Ab. b Die Bildung von VSO nach der Entwicklung von Para mithilfe von MNPs@Ab. c Der vorgeschlagene Mechanismus der Viruseinfangung und -inaktivierung durch E-Para. Die Virenerfassung durch E-Para umfasst vier Prozesse: 1. Virusaufnahme; 2. Bildung von virushaltigen Nahrungsvakuolen; 3. Nahrungsvakuolenfusion; 4. Virenerfassung durch MNPs@Ab. Die Virusinaktivierung durch E-Para wurde als 5. Virusinaktivierung angezeigt. d Magnetische Wiederherstellung von E-Para.

Magnetische Fe3O4-Nanopartikel (MNPs) wurden durch ein Solvothermalverfahren unter Verwendung von Natriumcitrat als Modifikator synthetisiert. Die Pulverröntgenbeugungsspektren (pXRD) bestätigten die Kristallinität der erhaltenen MNPs (ergänzende Abbildung 1). Da die Oberflächenchemie von MNPs ihre Stabilität in Para und ihre Zytotoxizität gegenüber Para beeinflussen kann, verwendeten wir Natriumcitrat und Polymere, einschließlich Polyethylenimin (PEI), Polyethylenglykol (PEG) und Polyacrylsäure (PAA), um die MNPs zu modifizieren wurden dann 2 Stunden lang mit Para inkubiert. Wie aus dem verbleibenden Fe-Gehalt im Para (ergänzende Abbildung 2) und dem Zytotoxizitätstest (ergänzende Abbildung 3) hervorgeht, ermöglichte Natriumcitrat-modifiziertes Fe3O4 (Fe3O4@Natriumcitrat) eine effiziente In-vivo-Retention und zeigte eine geringere Zytotoxizität als die anderen Modifikatoren. Daher wurde Trinatriumcitrat-Dihydrat während der Synthese der MNPs vor der Antikörpermodifikation zugesetzt. Die erfolgreiche Beschichtung der MNP-Oberfläche mit Natriumcitrat wurde durch Untersuchung der charakteristischen Peaks der CO-Streckschwingungen bei 1396 cm−1, der C = O-Streckschwingungen bei 1597 cm−1 und der O-H-Streckschwingungen bei 3416 cm− bestätigt 1 nach Modifikation mittels Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) (ergänzende Abbildung 4). Die Carboxygruppe von Natriumcitrat dient als reaktive Stelle für die Antikörpermodifikation. Der monoklonale Antikörper EV71 wurde mittels N-Ethyl-N′-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Konjugationschemie an die Oberfläche von MNPs gebunden. Bei der Antikörperkonjugation verschob sich das Zetapotential von MNPs@Ab von –6 auf –12 mV (ergänzende Abbildung 5).

Die Virusbindungsaffinität von MNPs@Ab allein wurde zunächst mithilfe eines Enzymimmunoassays (ELISA) untersucht, um zu bestätigen, dass MNPs@Ab Viren erkennen konnte. Die erhöhte OD, die bei der Zugabe von MNPs@Ab beobachtet wurde, deutete darauf hin, dass MNPs@Ab seine Bindungsaffinität gegenüber EV71 beibehielt (Abb. 2a). Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Analyse zeigte Abmessungen von MNPs@Ab mit einem Durchmesser von ∼162 nm (Abb. 2b). Darüber hinaus zeigten die MNPs@Ab eine Sättigungsmagnetisierung von etwa 62 emu/g, was mit der der MNPs-Kontrolle in Gegenwart von Antikörpern vergleichbar war (Abb. 2c).

Ein ELISA von MNPs@Ab bestätigte die Antikörperkonjugation. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. b TEM-Bild von MNPs@Ab und Größenverteilung von MNPs@Ab (Einschub). c Magnetische Hystereseschleifen von MNPs@Ab und MNPs. d, e Optische Mikroskopie d und TEM-Bilder e der Nahrungsvakuolen in natürlichem Para. Der hervorgehobene Vakuolenbereich wurde vergrößert. f, g Optische Mikroskopie f und TEM-Bilder g der Nahrungsvakuolen von E-Para. Der hervorgehobene VSO-Bereich wurde vergrößert. h Magnetische Hystereseschleifen für natürliches Para und E-Para. i Zur Herstellung von E-Para wurden Para 2 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von MNPs@Ab kokultiviert. Die erhaltenen E-Para wurden dann zur Toxizitätsbewertung weitere 24 Stunden lang in Medium ohne Fütterung kultiviert. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. j Geschwindigkeiten von natürlichem Para und E-Para. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. In i, j wurde die statistische Signifikanz über den zweiseitigen Student-t-Test berechnet. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Ns nicht signifikant.

Das In-vivo-VSO wurde durch Fütterung von Para mit MNPs@Ab (200 μg/ml)-haltiger modifizierter Dryl-Lösung (genannt KDS-Puffer, ein Phosphatpuffer, der häufig in Paramecium-Studien verwendet wird)35 für 2 Stunden bei 25 °C hergestellt. Zunächst verwendeten wir Phasenkontrastmikroskopie, um das E-Para vor und nach der Inkubation mit MNPs@Ab zu beobachten. Wie gezeigt, zeigte natürliches Para transparente Vakuolen, während E-Para dunkle und isolierte vakuolenartige Strukturen innerhalb der Zellen aufwies (Abb. 2d, f), was auf den Eintritt von MNPs@Ab während des Fütterungsprozesses hinwies. Anschließend wurde TEM verwendet, um die subzelluläre Verteilung von MNPs@Ab zu überprüfen. Die Vakuolen von natürlichem Para waren aufgrund von Hunger fast leer (Abb. 2e), wohingegen alle Vakuolen von E-Para mit großen Mengen an MNPs@Ab gefüllt waren (Abb. 2g). Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der Größe der so zubereiteten MNPs@Ab und der aufgenommenen MNPs@Ab in E-Para (in vivo) beobachtet (ergänzende Abbildung 6), was auf die Stabilität von MNPs@Ab hinweist. Darüber hinaus zeigte die magnetische Hystereseschleife für E-Para superparamagnetische Eigenschaften ähnlich denen von MNPs@Ab, während natürliches Para diamagnetisch war (Abb. 2h). Die intrazellulären MNPs@Ab wurden dann mittels induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) quantitativ ausgewertet, was 30,06 ± 2,44 μg Fe pro 104 E-Para-Zellen zeigte (ergänzende Abbildung 7). Diese Ergebnisse bestätigten die wirksame In-vivo-Bildung von VSOs innerhalb von Para (E-Para). Darüber hinaus waren die mit MNPs@Ab beladenen Vakuolen in Para mindestens 24 Stunden lang stabil und zeigten die Stabilität von VSO in E-Para (ergänzende Abbildung 8).

Die Wirkung von VSO auf die biologischen Eigenschaften von E-Para wurde weiter untersucht. Um die Zytotoxizität der implantierten VSOs zu beurteilen, berechneten wir die Überlebensrate36 von Para nach Koinkubation mit einer Serienkonzentration von MNPs@Ab. Die Ergebnisse zeigten, dass MNPs@Ab bei Konzentrationen von bis zu 200 μg/ml eine minimierte Zytotoxizität gegenüber Para aufwiesen, was eine akzeptable Biokompatibilität zeigte (Abb. 2i). Um abzuschätzen, ob die MNPs@Ab die sportliche Leistung von Para beeinflussen, haben wir die Bewegungsgeschwindigkeit des E-Para bewertet. Verglichen mit der des natürlichen Para (Zusatzfilm 1) nahm die Geschwindigkeit des E-Para leicht ab, was möglicherweise auf das erhöhte Gewicht des Para aufgrund der VSO-Implantation zurückzuführen ist, es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der Schwimmgeschwindigkeit (Abb. 2j) und Richtung (Zusatzfilm 2). Diese Ergebnisse zeigten, dass das E-Para nach der technischen Umsetzung weiterhin lebensfähig blieb.

Anschließend wurde die Virusaufnahme untersucht, indem E-Para oder Para (8 × 103 Zellen) 4 Stunden lang bei 25 °C in 1 ml EV71 (105 PFU/ml) gegeben wurden. Anschließend wurden die Para- und aufgenommenen Viren mithilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) beobachtet. Obwohl in beiden Gruppen mit rotem Farbstoff markiertes EV71 beobachtet wurde, fing E-Para mehr Viren ein als das natürliche Para, was zeigt, dass VSO die Viruseinfangkapazität steigerte (Abb. 3a, b). Darüber hinaus stellten wir fest, dass die roten Signale der Viren vollständig in den VSOs innerhalb des E-Para kolokalisiert waren (Abb. 3b). Dreidimensionale Konstruktionsbilder des E-Para überzeugten auch davon, dass die Viren im Inneren der Zellen lokalisiert waren, aber nicht an den Zelloberflächen absorbiert wurden. Wir haben auch Querschnittsansichten von E-Para verwendet, um zu bestätigen, dass EV71 von MNPs@Ab erfasst wurde (ergänzende Abbildung 9).

a, b Phasen- und CLSM-Bilder von Para a und E-Para b nach der Aufnahme des EV71. In vivo wurde EV71 durch Zusammenführen der Phasen- und Fluoreszenzbilder lokalisiert. Grün repräsentierte CMFDA-gekennzeichnetes Para und Rot repräsentierte AF555-gekennzeichnetes EV71. c Um die Viruseinfangkapazität von MNPs, MNPs@Ab, Para, mit MNPs modifiziertem Para (Para-MNPs), mit Antikörper gefüttertem Para (Para-Ab) und E-Para zu bestätigen, wurde das verbleibende EV71 im Wasser nach der Kokultivierung untersucht die obigen Proben mit EV71 für 24 h. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests berechnet. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Ns nicht signifikant. d Zeitabhängige Virenerfassung durch Para und E-para. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. e Menge des viralen Genoms, das nach 24-stündiger Behandlung mit unterschiedlichen Mengen Para und E-Para in EV71-kontaminiertem Wasser verbleibt (1,5 × 105 Kopien/ml). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. f Menge des viralen Genoms, das nach 24-stündiger Behandlung mit unterschiedlichen Mengen Para und E-Para in EV71-kontaminiertem Wasser verbleibt (3,2 × 108 Kopien/ml). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. g Die log10-Reduktionen der viralen Genomspiegel wurden berechnet, nachdem unterschiedliche Volumina von EV71-Lösungen mit E-Para oder Para (6,4 × 104 Zellen/ml) behandelt wurden. h Zur Entfernung generischer Viren wurden MNPs mit Sialinsäure (SA) modifiziert, die gleichzeitig EV71, H1N1 und Ad5 aus der Lösung entfernte, was die Vielseitigkeit dieser Strategie widerspiegelt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt.

Um festzustellen, ob die Viruseinfangwirkung von Antikörpern auf den MNPs abhängt, verglichen wir die Effizienz der Viruseinfangung von MNPs, MNPs@Ab, Para, das von MNPs ohne Antikörpermodifikation entwickelt wurde (Para-MNPs), oder Para, das nur mit Antikörpern gefüttert wurde (Para-Ab). ) mit dem von E-Para durch Bestimmung des viralen Genoms, das nach 24-stündiger Inkubation in Suspension verbleibt. Das Vorhandensein von Antikörpern auf MNPs@Ab zeigte keine signifikante Verbesserung der Viruseinfangung, da MNPs instabil sind und dazu neigen, in Lösung zu aggregieren37, was zu einer verringerten Virusbindungsaffinität führt (Abb. 3c). Darüber hinaus bleibt die Viruseinfangfähigkeit von Para-Ab, Para-MNPs und nativem Para auf einem niedrigeren Niveau als die von E-para (Abb. 3c). Bei Para-Ab konnte der Antikörper keine hohe lokale Konzentration in den Vakuolen erreichen. Somit wurden die aufgenommenen Viren nicht effizient in Vakuolen zurückgehalten und konnten ausgeschieden werden. Im Gegensatz dazu führte die Aufnahme von MNPs@Ab in VSO zu einer langfristigen Retention und Anreicherung von Antikörpern in E-Para, was zu einer hohen Viruseinfangeffizienz führte. Dieses Ergebnis bestätigte, dass die Anlagerung virusspezifischer Antikörper an MNPs die Fähigkeit von VSO, Viren einzufangen, erheblich ermöglichte.

Anschließend wurde die Virusabfangeffizienz von E-para oder Para im Laufe der Zeit untersucht. Bei Para führte die Einfangdauer von 8 bis 24 Stunden nur zu einer Reduzierung der viralen Genommenge um 0,8 log10. Im Gegensatz dazu verbesserten die VSOs von E-Para die Einfangeffizienz im Laufe der Zeit drastisch und führten schließlich nach 24 Stunden zu einer vollständigen Beseitigung des viralen Genoms (Abb. 3d). Die verbleibenden Viren im Überstand wurden ebenfalls mittels indirekter Immunfluoreszenzanalyse (IFA) validiert. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Anzahl der infizierten Rhabdomyosarkomzellen (RD) nach der Behandlung mit E-Para reduziert wurde (ergänzende Abbildung 10), was mit den RT‒qPCR-Ergebnissen übereinstimmte und zeigte, dass E-Para das Virus effektiver einfing als Para. Diese Ergebnisse zeigten, dass VSO eine wichtige Rolle bei der Virenerfassung spielt. Die aktuelle Herausforderung für die Kontrolle von durch Wasser übertragenen Krankheiten besteht darin, dass die geringe Größe und die sehr geringen Konzentrationen im Umweltwasser die Virenentfernung mit herkömmlichen Filtergeräten äußerst schwierig machen. Wir haben jedoch festgestellt, dass E-para eine hohe Wirksamkeit beim Einfangen von Viren kleinerer Größe (ca. 30 nm) und geringerer Konzentration auf effektive und umweltfreundliche Weise zeigte, ohne dass zusätzliche Geräte erforderlich waren.

Das dosisabhängige Virenabfangverhalten von E-Para zeigte, dass EV71 bei einer Konzentration von 1,5 × 105 Kopien/ml innerhalb von 24 Stunden nach der Inkubation vollständig durch 8 × 103 Zellen/ml E-Para entfernt wurde (Abb. 3e). Die zur Beseitigung dieser Viren erforderliche Mindestkonzentration betrug 8 × 103 Zellen/ml E-Para (Abb. 3e). Bemerkenswert ist, dass bei einer Erhöhung der Viruskonzentration auf 3,2 × 108 Kopien/ml mindestens 6,4 × 104 Zellen/ml E-Para erforderlich waren, um diese Viren vollständig zu beseitigen, was auf eine dosisabhängige Virusentfernung hinweist (Abb. 3f). Im Gegensatz dazu führte eine Erhöhung des Gehalts an nativem Para nicht zu einer signifikanten Verbesserung der Virusentfernung (Abb. 3e, f), was mit früheren Ergebnissen übereinstimmt21. Die Infektiosität der mit E-Para behandelten EV71-kontaminierten Lösung wurde auch mit einem Plaque-Bildungstest gemessen (ergänzende Abbildung 11). Darüber hinaus wurde die Machbarkeit der VSO-basierten Viruseinfangung durch Erhöhung der Volumina der EV71-haltigen Lösungen ermittelt. Mit zunehmendem Wasservolumen führte die E-Para-Behandlung zu einer Reduzierung des Virusgenoms um 8 log10 und übertraf damit den WHO-Standard (4 log10-Reduktionswert) (Abb. 3g)38. Darüber hinaus zeigte die Entfernungseffizienz keinen offensichtlichen Rückgang, wenn das Volumen auf 2500 ml erhöht wurde, was auf eine bevorzugte Verarbeitungskapazität bei großen Wassermengen hinweist.

Die auf Antikörpern basierende virusspezifische Erfassung gilt nicht nur für andere Arten von durch Wasser übertragenen Viren. Im Falle der Reinigung von Wasser von der breiten Vielfalt wasserübertragener Viren ist auch die Ausstattung des E-Para mit VSO erforderlich, das auf verschiedene Arten potenzieller Viren abzielt. Daher haben wir die MNPs mit Sialinsäure (SA) modifiziert, einem Monosaccharid und einer Schlüsselkomponente für die Rezeptorbindung an Viren wie Enterovirus, Influenza und Adenovirus39,40,41, um die Vielseitigkeit der VSO-basierten Strategie zu überprüfen. Nach der Modifikation von SA verschob sich das Zetapotential der MNPs@SA von 26,6 auf –9,1 mV (ergänzende Abbildung 12a). Die SA-modifizierten MNPs (MNPs@SA) zeigten die charakteristischen FTIR-Peaks für N-H-Streckschwingungen bei 3385 cm−1, C = O-Streckschwingungen bei 1617 cm−1, N-H-Biegeschwingungen bei 1541 cm−1, C –O–C asymmetrische Streckschwingungen bei 1278 cm–1 und C–O–C symmetrische Streckschwingungen bei 1068 cm–1 (Ergänzende Abbildung 12b).

Para wurde von MNPs@SA auf die gleiche Weise wie E-Para entwickelt und erhielt den Namen E-Para-SA. Das E-Para-SA wurde zur Behandlung einer Lösung verwendet, die EV71 (8,2 × 107 Kopien/ml), H1N1 (1,4 × 108 Kopien/ml) und Ad5 (4,6 × 107 Kopien/ml) enthielt. Aufgrund der Bindung der Viren an Glykane der Sialinsäure betrugen die log10-Reduktionswerte für EV71, H1N1 und Ad5 durch E-Para-SA 6, 5 bzw. 5 (Abb. 3h), was auf eine deutlich höhere Virus- Erfassungseffizienz als natives Para. Die Entfernungseffizienz für die drei Viren erreichte 99,99 %, was mehr als 4 log10 Kopien/ml entspricht. Diese Daten deuten auf eine generische Fähigkeit zum Einfangen von Viren hin, was darauf hindeutet, dass die Vielseitigkeit von VSO durch rationales Design funktioneller Gruppen auf den MNPs angepasst werden kann.

Wie fangen MNPs@Ab-haltige VSOs Viren ein? CLSM-Bilder des Viruseinfangs durch E-Para zeigten die Co-Lokalisierung von Viren (rot) und MNPs@Ab (schwarz im Phasenbild) in denselben Vakuolen von E-Para (Abb. 3b). Dieses Ergebnis bestätigte, dass die neu aufgenommenen Viren in die bereits vorhandenen VSOs gelangten. Um zu untersuchen, wie Nahrung von neuen Vakuolen zum VSO von E-Para gelangt, inkubierten wir E-Para (ergänzende Abbildung 13a, b) mit Escherichia coli (E. coli) und beobachteten die Bildung von Vakuolen, die sowohl Bakterien als auch MNPs@Ab enthielten gleichzeitig. E. coli wurde von E-Para über das Zytostom aufgenommen (ergänzende Abbildung 13c), um eine neue, blau markierte Nahrungsvakuole (FV) zu bilden (ergänzende Abbildung 13d). Wir fanden E. coli-haltige Vakuolen, die mit MNPs@Ab-haltigem VSO fusioniert waren, was auf die Nahrungspassage über den Fusionsweg einer Vakuole hinweist (ergänzende Abbildung 13e – h). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Viruseinfangung durch VSO auf der Nahrungspassage von Para beruht, bei der virushaltige Vakuolen in vivo mit zirkulierenden VSOs fusionierten. Nach dem Eintritt in das VSO wurden die Viren von Antikörpern im VSO eingefangen (Abb. 3c). Wenn Antikörper nicht an MNPs gebunden sind, konnten diese nicht über einen längeren Zeitraum in Para-Vakuolen eingeschlossen und konzentriert werden, was zu einer geringen Viruseinfangmenge führte (Abb. 3c). Im Gegensatz dazu führte die langfristige Retention und Anreicherung von MNPs@Ab in VSO zu einer hohen lokalen Antikörperkonzentration in Vakuolen (ergänzende Abbildung 8), was sich positiv auf das Einfangen und Einschließen von Viren durch Antikörper im VSO auswirkt und so die Virus- Erfassungseffizienz von E-Para (Abb. 3c).

Die Virusinaktivierung durch E-Para wurde bewertet, indem die Infektiosität von E-Para-eingefangenen Viren mithilfe von Plaque-Bildungstests untersucht wurde. Nachdem EV71 24 Stunden lang eingefangen wurde, wurden die Viren in Para und E-Para durch Zelllysebehandlungen freigesetzt und dann zur Infektion von RD-Zellen verwendet, um die verbleibende Infektiosität zu bestimmen. Als Kontrolle zeigte die Zelllysebehandlung mit dem SDS-Lysepuffer nur geringe Auswirkungen auf die virale Infektiosität (ergänzende Abbildung 14). Bemerkenswert ist, dass die von E-Para aufgenommenen Viren ihre Infektiosität vollständig verloren (Abb. 4a), was darauf hindeutet, dass E-Para die Viren nicht nur einfängt, sondern auch inaktiviert. Im Gegensatz dazu wurde der Titer der durch natürliches Para eingefangenen Viren um weniger als 1 log10 PFU/ml reduziert, was darauf hindeutet, dass die Viren durch natürliches Para nicht vollständig inaktiviert wurden (Abb. 4a). Darüber hinaus hatte MNPs@Ab allein keine viruzide Wirkung in Wasser (Abb. 4a). Die Inaktivierung aufgenommener Viren durch E-Para näherte sich 100 %, während natürliches Para und MNPs@Ab 70,87 % bzw. keine Inaktivierung zeigten (Abb. 4b). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Viren in den Vakuolen von nativem Para oder nach der Behandlung mit MNPs@Ab infektiös blieben, während die VSOs in E-Para die befallenen Viren vollständig inaktivierten, was auf einen synergetischen Deaktivierungseffekt von MNPs@Ab in Vakuolen schließen lässt. Para schirmte die Viren und Virusgenome in den Vakuolen ab, die infektiös blieben. Anschließend untersuchten wir, ob E-Para oder Para das aufgenommene Virus nach 24-stündiger Inkubation mit EV71 vollständig inaktivierte. Bei natürlichem Para blieb das aufgenommene Virus infektiös und das virale Genom war nachweisbar, was auf das potenzielle Risiko bei der Verwendung von natürlichem Para zur Viruseinfangung hinweist. Dennoch wurde für E-Para in VSO kein restliches virales Genom nachgewiesen (Abb. 4c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass E-Para die aufgenommenen Viren in den VSOs effektiv abfängt.

ein Intra-Para EV71-Titer, der mit dem Plaque-Bildungstest nachgewiesen wurde. b Inaktivierungseffizienzen von MNPs@Ab, Para und E-Para. c Virusgenom, das nach der Behandlung in E-Para- oder Para-Zellen verbleibt. d EPR-Spektren von MNPs@Ab bei verschiedenen pH-Werten. e Vergleich der katalytischen Kapazitäten von MNPs@Ab, natürlichem Para und E-Para gegenüber TMB. f Die dosisabhängige katalytische Kapazität von E-Para. g Fluoreszenzbilder von Para und E-Para, gefärbt mit ROSGreenTM (einer H2O2-Sonde mit grüner Fluoreszenz). h H2O2-Gehalte in Para und E-Para. i Fluoreszenzintensität von •OH gemessen mit ImageJ. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. j, k Fluoreszenzbilder von Para j und E-Para k, gefärbt mit HPF (einer •OH-Sonde mit grüner Fluoreszenz). Die Bilder in den gelben Kästchen sind teilweise vergrößert (Balken, 20 μm). Statistische Vergleiche wurden entweder mit dem zweiseitigen Student-t-Test (a, b, e) oder mit bidirektionalen Varianzanalysen (ANOVA) mit Tukeys Mehrfachvergleichstest c durchgeführt. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Ns nicht signifikant.

Da Eisenoxid in sauren pH-Umgebungen eine Peroxidase-ähnliche Aktivität aufweist, ist der MNPs@Ab in den VSOs in der Lage, Hydroxylradikale (•OH) zu erzeugen, indem er Wasserstoffperoxid (H2O2) durch eine Fenton-ähnliche Reaktion katalysiert34. •OH kann Viren inaktivieren, da es mit fast allen Arten von Biomolekülen wie Lipiden und Nukleotiden reagiert42,43. Um die Peroxidase-ähnliche Aktivität von MNPs@Ab in vitro zu untersuchen, wurde die Elektronenspinresonanzspektroskopie (EPR) verwendet. Bei pH 3,5 zeigte MNPs@Ab mit DMPO/•OH (ergänzende Abbildung 15) in Gegenwart von H2O2 stärkere dosisabhängige EPR-Signale (1:2:2:1) als ohne zugesetztes H2O2 (Abb. 4d). . Dennoch wurde bei pH 7,4 kein •OH-Signal für MNPs@Ab oder die Mischung aus MNPs@Ab und H2O2 nachgewiesen (Abb. 4d). Daher erzeugten MNPs@Ab in sauren Lösungen, die H2O2 enthielten, hochreaktives •OH.

Um die antivirale Fähigkeit von MNPs@Ab-induziertem •OH in vitro zu verifizieren, inkubierten wir MNPs@Ab (200 μg/ml) mit EV71 in Gegenwart von H2O2 (1 mM) bei unterschiedlichen pH-Werten für 24 Stunden und untersuchten den verbleibenden Titer von EV71 durch Plaque-Assay. In sauren Lösungen, die H2O2 enthielten, wurde die Infektiosität von EV71 durch MNPs@Ab (ergänzende Abbildung 16) aufgrund der Bildung von hochreaktivem •OH (Abb. 4d und ergänzende Abbildung 15) wirksam reduziert. Im Gegensatz dazu war der MNPs@Ab bei pH-Werten von 6, 7 und 8 nicht in der Lage, EV71 zu inaktivieren.

Wir haben auch die Peroxidase-ähnliche Aktivität von MNPs@Ab innerhalb der VSOs in vivo getestet. 3,3,5,5-Tetramethylbenzidin (TMB), ein Substrat der Peroxidase, reagiert mit Eisenoxid in Gegenwart von H2O2 unter sauren Bedingungen und entwickelt eine blaue Farbe mit einer maximalen Absorption bei 652 nm33. Wir haben daher TMB zu KDS-Puffer mit E-Para hinzugefügt, um nach dem blauen Produkt zu suchen. Wie erwartet produzierten sowohl Para- als auch E-Para-Zellen in vivo einen blauen Katalysator (ergänzende Abbildung 17), während die Absorption bei 652 nm für TMB-behandelte E-Para offensichtlich stärker war als die von natürlichem Para (Abb. 4e). Dies deutet darauf hin, dass in E-Para eine verstärkte katalytische Reaktion stattgefunden hat. Bemerkenswert ist, dass die Enzymaktivität mit zunehmender MNPs@Ab-Konzentration zunahm, was bestätigt, dass der katalytische Effekt tatsächlich mit MNPs@Ab in den VSOs zusammenhängt (Abb. 4f).

Um das Vorhandensein von H2O2 in Para, ROSGreenTM, zu überprüfen, wurde eine spezielle H2O2-Sonde verwendet, die bei Kontakt mit H2O2 grüne Fluoreszenz aussendet. Sowohl Para als auch E-Para zeigten das Vorhandensein von intrazellulärem H2O2 (Abb. 4g), das hauptsächlich aus Lysosomen oder Peroxisomen im Zytoplasma stammte44. Aufgrund der Anwesenheit von MNPs@Ab stiegen die H2O2-Werte in den VSOs innerhalb der ersten 8 Stunden schneller an als bei Para und sanken dann schneller als bei Para, was auf einen beschleunigten H2O2-Verbrauch hindeutet (Abb. 4h).

Umfangreiche Studien haben gezeigt, dass die Nahrungsvakuole von Para eine Phase mit saurem pH-Wert (30,32,45) durchläuft, der zusammen mit dem H2O2 in der Vakuole günstige Bedingungen für die Reaktion zwischen Fe (II) und H2O2 schafft, die zu •OH führt . Wir verwendeten 3′-(p-Hydroxyphenyl)fluorescein (HPF), um die Bildung von •OH zu verfolgen. Interessanterweise wurden bei 0 h mehr aggregierte grün fluoreszierende Vakuolen in so hergestelltem E-Para (Abb. 4k) beobachtet als in natürlichem Para (Abb. 4j), was die schnelle Produktion von •OH innerhalb der VSOs bestätigt. Die •OH-Produktion war dann in E-Para 8 Stunden nach der VSO-Technik deutlich erhöht, was auf die Produktion großer Mengen an •OH in den VSOs hinweist (Abb. 4i). Danach begann die Menge an •OH zu sinken, wahrscheinlich aufgrund des Verbrauchs von •OH während des Virusinaktivierungsprozesses. Die Kolokalisation intrazellulärer MNPs@Ab und das •OH-Fluoreszenzsignal bestätigten die entscheidende Rolle von MNPs@Ab bei der Erzeugung von •OH in den Vakuolen (Abb. 4k).

Diese Phänomene deuteten darauf hin, dass die VSOs in E-Para zu einem kontinuierlich höheren Gehalt an •OH als in nativem Para führten, was zu einer Redoxschädigung des aufgenommenen Virus führte. Gemeinsam nutzten die VSOs das synergistische Zusammenspiel zwischen MNPs@Ab und der Vakuolenumgebung, um eine nachhaltige Produktion von •OH zu erreichen, was eine effiziente Virusinaktivierung ermöglichte.

Im Falle von Biosicherheitsproblemen, die durch im Wasser eingefangene E-Para-Viren verursacht werden, ist es wichtig, die verbrauchten E-Para nach der Behandlung zurückzugewinnen. Aufgrund ihrer hervorragenden Beweglichkeit ist es jedoch schwierig, Para mit herkömmlichen Sammelmethoden zu sammeln. Das VSO-implantierte E-Para konnte durch einen externen Magneten leicht aus der Wasserlösung gewonnen werden (Abb. 5a) und konnte sich nach Entfernen des Magneten wieder frei bewegen (Zusatzfilm 3), was bestätigt, dass die magnetische Erholung keinen signifikanten Einfluss auf die Aktivität von hatte E-Abs. Darüber hinaus haben wir E-Para mit 4 % Paraformaldehyd abgetötet und festgestellt, dass das abgetötete E-Para superparamagnetische Eigenschaften ähnlich denen von MNPs@Ab aufwies, was darauf hinweist, dass das abgetötete E-Para aufgrund von VSO auch recycelbar ist (Abb. 2h). Die magnetische Rückgewinnungseffizienz von E-Para hing mit der Konzentration von MNPs@Ab in VSO zusammen (Abb. 5b). Darüber hinaus wurde die magnetische Rückgewinnung von E-Para aus verschiedenen Lösungsvolumina durch das erhöhte Wasservolumen nicht beeinflusst, was darauf hindeutet, dass die E-Para-Entfernung möglich ist, ohne dass eine zusätzliche Behandlung der Lösung erforderlich ist (Abb. 5c).

a Wiederherstellung von Para und E-Para mit einem Magneten. Die Bilder wurden mit einem Stereomikroskop aufgenommen. b Auswirkung der eingebauten MNPs@Ab-Konzentration auf die magnetische Rückgewinnung des E-Para. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. c Einfluss des Lösungsvolumens auf die magnetische Rückgewinnung von E-Para. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. d Wiederverwendung von E-Para. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. In b, c und d wurde die statistische Signifikanz mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests berechnet. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Ns nicht signifikant.

Die zeitliche Variation des Magnetismus von E-Para zeigte jedoch einen leichten Rückgang der Sättigungsmagnetisierung von 3,4 auf 1,7 emu/g innerhalb von 24 Stunden (ergänzende Abbildung 18a). Der Fe-Gehalt im E-Para nahm innerhalb von 72 Stunden weiter ab (ergänzende Abbildung 19a), was zu einer Verringerung der Sättigungsmagnetisierung führte. Die Reduzierung der MNPs hatte jedoch einen vernachlässigbaren Einfluss auf die magnetische Wiederherstellungsrate von E-Para innerhalb von 24 Stunden (ergänzende Abbildung 18b). Wenn E-Para mit der Zeit in einem Hungermedium kultiviert wurde, begann ihre Lebensfähigkeit außerdem nach 24 Stunden abzunehmen (ergänzende Abbildung 19b), was auf eine langfristige Toxizität von MNPs@Ab auf Para hinweist. Die Verbreitung von E-Para sollte auch durch die Verwendung von Hungermedium eingeschränkt werden, um die durch die Teilung von E-Para verursachte Verringerung des VSO zu vermeiden (ergänzende Abbildung 19c). Um einen weiteren Verlust der Recyclingfähigkeit zu vermeiden, sollte die Viruseinfangzeit insgesamt auf 24 Stunden begrenzt werden.

Die recycelten E-Para wurden dann in einem mit E. coli ergänzten Wachstumsmedium kultiviert, um die Proliferation von Para zu fördern (ergänzende Abbildung 19d). Um die Abnahme von MNPs@Ab in einzelnen Zellen zu vermeiden (ergänzende Abbildung 19c), wurden proliferierte Para mit MNPs@Ab umgestaltet, um die VSOs vor der Wiederverwendung wiederherzustellen. Das reaktivierte E-Para führte nach zehn Zyklen immer noch zu einer Reduzierung der viralen Genomwerte um 8 log10 (Abb. 5d), was auf die Machbarkeit des Recyclings und der Wiederverwendung dieses Systems hinweist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die magnetischen VSOs eine effiziente Rückgewinnung von E-Para mit einem Magnetfeld ermöglichten, was die Wiederverwendung erleichterte und das Infektionsrisiko vermied und so die Umweltfreundlichkeit und Biosicherheit dieser Strategie gewährleistete.

Der Kernpunkt unseres Entwurfs besteht darin, eine MNP-basierte Plattform zum Abfangen biologischer Viren zu erhalten, die auf lebendem Para basiert. Der Einbau modifizierter magnetischer Fe3O4-Nanopartikel in Para über den Nahrungsaufnahmeprozess ist einfach und effizient. Fe3O4-Nanopartikel mit geeigneten Modifikatoren zeigen Biokompatibilität in künstlich hergestelltem Para in angemessener Konzentration und integrieren sich in Nahrungsvakuolen von Para, um eine funktionalisierte bioartifizielle Organelle zu bilden. Der zugrunde liegende Mechanismus der Viruseinfangung durch E-Para hängt mit der Verwendung von MNPs@Ab zusammen, um in den Prozess der Nahrungsaufnahme, -passage und -verdauung einzugreifen. Zunächst bildeten sich die virusabfangenden Nahrungsvakuolenorganellen (VSOs) nach der zweistündigen Fütterung von nativem Para mit MNPs@Ab über einen Nahrungsaufnahmeweg, über den die MNPs@Ab in die Nahrungsvakuolen gelangten und dort mindestens 24 Stunden lang verblieben. Im Einklang mit diesen Ergebnissen zeigt ein früherer Bericht auch, dass anorganische Nanomaterialien über eine Flimmerrille direkt in die Vakuolen von Para geladen werden können. Die aufgenommenen Nanomaterialien wie Quantenpunkte (QDs) stoppen die Verdauung und Ausschleusung nanopartikelhaltiger Vakuolen46 und sorgen so für eine lange Lebensdauer in den Vakuolen. Darüber hinaus können Para Nahrungspartikel über ihre Zytostome ansammeln und aufnehmen und Vakuolen bilden, die auf einem bestimmten Weg im Endoplasma, der Zyklose genannt wird, durch den Körper zirkulieren30. Somit können die VSOs mit langer Lebensdauer mindestens 24 Stunden lang in E-Para zirkulieren, was für die anschließende Viruseinfangung von Vorteil ist. Wie gelangt das Virus dann in MNPs@Ab-haltige VSOs? Wir beobachteten eine dynamische Membranfusion und einen Substanzaustausch zwischen neu gebildeten Nahrungsvakuolen, die E. coli enthielten, und zirkulierenden VSOs (ergänzende Abbildung 13). Ebenso ist das Virus auch in der Lage, mit MNPs@Ab zu kolokalisieren. Zusammengenommen bestätigen diese Daten, dass das Virus durch Fusion neuer Vakuolen mit alten Vakuolen in das VSO von E-Para gelangen kann, was auf einen Nahrungsdurchgangsweg hinweist (Abb. 1c). Nach Eintritt in das VSO kann das Virus von den Antikörper-bindenden MNPs erkannt und eingefangen werden. Bei nativem Para kann das Virus nicht effizient in Nahrungsvakuolen zurückgehalten und daher ausgeschieden werden22. Die Verwendung von schwer freizusetzenden MNPs zur Abgabe von Antikörpern in die Nahrungsvesikel trägt dazu bei, eine schnelle Freisetzung von Antikörpern zu vermeiden und kann so Antikörper in den Nahrungsvesikeln zurückhalten und anreichern. Dadurch wurde die Virenabfangeffizienz von E-Para erheblich verbessert. Wir glauben, dass die Fähigkeit von E-Para, Viren einzufangen, hauptsächlich durch den Standort und die hohe lokale Konzentration des Antikörpers bestimmt wird. Die vakuolenbasierte Aufnahme von Materialpartikeln ist bei einzelligen Protozoen üblich und könnte als allgemeine Modifikationsstrategie entwickelt werden.

Der Vorteil der Verwendung halbkünstlicher Organellen mit Peroxidase-ähnlicher Aktivität besteht darin, dass das Wasserstoffperoxid und die sauren Umgebungen in Lebensmittelvakuolen stabil und konstant waren. Eine kontinuierliche Zufuhr von Wasserstoffperoxid verbesserte die katalytische Wirkung der MNPs erheblich und ermöglichte es Nanozymen, •OH zu produzieren. Somit war die In-vivo-Inaktivierungseffizienz deutlich höher als die in der In-vitro-Umgebung. Im Gegensatz zu anderen herkömmlichen Desinfektionsmethoden fängt der VSO-tragende Para Viren ein und inaktiviert sie, ohne dass eine zusätzliche Desinfektionsbehandlung erforderlich ist. Andererseits zeigte unser Ergebnis, dass natives Para 70,87 % des eingefangenen Virus abtöten konnte. Frühere Literatur22 berichtet, dass Para das Virus entweder durch die Produktion von Metaboliten, die sich negativ auf das Virus auswirken, oder durch die direkte Verdauung des Virus als Nahrung inaktiviert. Somit tötete natürliches Para zusätzlich zur verstärkten •OH-Produktion durch MNPs@Ab auch das Virus durch seine intrinsische Fähigkeit.

Um Sekundärverschmutzung zu vermeiden, gewinnen wir E-Para nach 24-stündiger Inkubation mit dem Virus mit einem Magneten zurück und verwenden sie erneut. Die Überlebensrate von E-Para lag innerhalb von 24 Stunden bei etwa 99 %, was eine effektive Viruserfassung und -inaktivierung gewährleistet. Eine Verlängerung der Einfangzeit wird nicht empfohlen, da die Lebensfähigkeit und die superparamagnetischen Eigenschaften von E-Para mit zunehmender Zeit abnehmen, was das Risiko eines Virusaustritts erhöht. Falls E-Para nicht vollständig aus dem Wasser entfernt werden kann, führt das verbleibende E-Para nicht zu einer Verschmutzung des Umweltwassers, da Para kein pathogener Krankheitserreger ist und sogar schädliche Mikroorganismen19,29 und Schadstoffe47,48 aus dem Wasser entfernen kann. Bei der Trinkwasseraufbereitung kann sich das im Wasser verbleibende E-Para vermehren und zu Schadstoffen werden. Die Entfernung von Para ist jedoch einfacher als die Entfernung von durch Wasser übertragenen Viren, sodass zur Reinigung das allgemeine Reinigungsverfahren für Trinkwasser genutzt werden kann.

Das auf Antikörpern basierende VSO erfasst nur Viren, die von Antikörpern erkannt werden können. Dennoch ist die auf Antikörpern basierende virusspezifische Strategie nicht auf andere Arten von durch Wasser übertragenen Viren anwendbar. Im Falle der Reinigung von Wasser von der Vielzahl wasserübertragener Viren ist die Ausstattung des E-Para mit VSO erforderlich, die auf verschiedene Arten potenzieller Viren abzielen. Daher haben wir das Para mit MNPs@SA so konstruiert, dass es auf mehr potenzielle Viren abzielt, da SA ein gut identifizierter Rezeptor für mehrere Viren wie Enterovirus, Influenza und Adenovirus ist. Mit MNPs@SA-haltigem VSO modifiziertes Para entfernt EV71, H1N1 und Ad5 um 99,99 %, was die Vielseitigkeit von VSO unterstreicht. Sowohl die antikörperbasierten als auch die SA-basierten VSOs erzielten eine Reduzierung der viralen Genomwerte um mehr als 4 log10 und übertrafen damit den Standard der WHO38.

Da es sich um eine Proof-of-Concept-Studie handelt, ist bis zur praktischen Anwendung noch viel Arbeit erforderlich. Basierend auf unserem derzeitigen Verständnis sollten mehrere Probleme weiter angegangen werden, um eine erfolgreiche Anwendung sicherzustellen, wie etwa die Kosten und eine Fähigkeit zur Virenabfangung mit einem breiteren Spektrum. Darüber hinaus sind Untersuchungen zur Bewertung der langfristigen biologischen Sicherheit des mit E-Para behandelten Wassers von entscheidender Bedeutung. Das aus künstlichen Organellen hergestellte Para ermöglicht die Entfernung und Inaktivierung von Viren mit hoher Effizienz, geringem Energieverbrauch und minimaler Umweltverschmutzung.

Zusammenfassend haben wir ein virusabfangendes halbkünstliches Organell entwickelt, um Para mit der Fähigkeit auszustatten, das Virus einzufangen, zu deaktivieren und das eingefangene Virus wiederherzustellen. Bei den maßgeschneiderten VSOs handelt es sich um von Vakuolen abgeleitete Kompartimente, die aus virusbindenden magnetischen Fe3O4-Nanopartikeln bestehen, die im Inneren von Para zirkulieren, da die anorganischen Nanopartikel die Verdauung und Ausscheidung von VSOs blockieren. Das E-Para diente als effiziente „Mikrofabrik“, um das Virus in situ durch einen enzymähnlichen Katalyseweg zu inaktivieren, bei dem das VSO große Mengen an Hydroxylradikalen produzierte, um die eingefangenen Viren abzutöten. Im Gegensatz zu herkömmlichen Technologien, die Hochdruckfiltration und schädliche chemische Behandlung nutzen, nutzt unsere Strategie materialtechnisch hergestellte, steuerbare Mikroorganismen, um Viren zu sammeln und zu entfernen, was nur minimalen Energieaufwand erfordert und umweltfreundlich ist. Insgesamt zeigt unsere Studie, dass eine funktionelle Modifikation von Mikroorganismen durch die Entwicklung einer auf Nanotechnologie basierenden künstlichen Organelle vielversprechend ist, was für die Förderung der materialbasierten biologischen Evolution von erheblicher Bedeutung ist.

FeCl3·6H2O (99 %), PEI (MW ~ 2500), PEG (MW ~ 2000) und PAA (MW ~ 3000) sowie Sialinsäure wurden von Aladdin (Shanghai, China) bezogen. Trinatriumcitrat-Dihydrat und BSA wurden von MACKLIN (Shanghai, China) bezogen. EDC, NHS, DMPO und der monoklonale Anti-Maus-EV71-Antikörper wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Alexa Fluor 555-Farbstoff, Celltracker Green CMFDA und hoch kreuzadsorbierter Ziegen-Anti-Maus-IgG (H + L)-Sekundärantikörper, konjugiert mit Alexa Fluor Plus 555, wurden von Thermo Fisher (Waltham, USA) erworben. Ein TIANamp-Virus-DNA/RNA-Kit (#DP315) wurde von Tiangen Biotech (Peking, China) erworben. Ein One-Step TB Green PrimeScriptTM RT − PCR Kit II (#RR086A) wurde von TaKaRa (Peking, China) erworben. Die TMB-Einkomponenten-Substratlösung (PR1200) wurde von Solarbio (Peking, China) bezogen. Die SDS-Lyse wurde von Beyotime (Shanghai, China) gekauft. Die ROSGreenTM H2O2-Sonde wurde von Maokang Biotechnology (Shanghai, China) gekauft. HPF wurde von AAT Bioquest (Sunnyvale, USA) gekauft.

Paramecium caudatum-Kulturen wurden in E. coli enthaltendem Salatsaftmedium gehalten. als Nahrung. Die Zubereitung des Salatsaftmediums erfolgte wie folgt49,50: Frische Salatblätter wurden gewaschen und einige Minuten lang in kochendes Wasser getaucht und dann zum Abkühlen in kaltes Wasser gelegt. Anschließend wurden die Blätter mehrmals mit dem Entsafter behandelt und durch Gaze ausgedrückt. Zur Verwendung als Medium wurde der Saft 1:40 mit KDS-Puffer (2 mM C6H5Na3O7·2H2O, 0,6 mM KH2PO4, 1,4 mM Na2HPO4, 1,5 mM CaCl2) verdünnt und 24 Stunden mit E. coli inkubiert. Para wurden in einem Inkubator mit konstanter Temperatur bei 25 °C kultiviert.

Kurz gesagt, FeCl3·6H2O (0,1 M) und Trinatriumcitrat-Dihydrat (50 mM) wurden zunächst in Ethylenglykol (30 ml) gelöst; Anschließend wurde unter Rühren NaAc (1,8 g) zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten lang kräftig gerührt und dann in einem mit Teflon ausgekleideten Edelstahlautoklaven (50 ml Fassungsvermögen) verschlossen. Der Autoklav wurde auf 200 °C erhitzt, 10 Stunden lang gehalten und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen51,52,53. Die schwarzen Produkte wurden mehrmals mit Ethanol und entionisiertem Wasser gewaschen.

Die Synthese von Fe3O4@PEI, Fe3O4@PEG und Fe3O4@PAA verlief ähnlich wie die von MNPs, mit der Ausnahme, dass der Stabilisator PEI, PEG oder PAA anstelle von Natriumcitrat war.

Der MNPs@Ab wurde durch Konjugation des monoklonalen Antikörpers EV71 an die MNPs hergestellt. Die Konjugation wurde durch die N-Ethyl-N′-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Strategie54,55 realisiert. Im Detail wurde 1 ml MNPs (5 mg/ml) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit EDC (0,1 M) und NHS (0,7 M) gemischt. Die restlichen Reagenzien der Kopplungsreaktion wurden über einen Magneten entfernt. Anschließend wurden die Nanopartikel mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und schließlich in 1 ml PBS resuspendiert. Als nächstes wurden 100 µl EV71-Antikörperlösung (1:100) zur aktivierten Nanopartikelsuspension gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Überschüssiger unkonjugierter EV71-Antikörper wurde ebenfalls über einen Magneten entfernt. BSA (1 %) wurde verwendet, um die unspezifischen aktiven Stellen zu blockieren.

Para wurden aus E. coli enthaltendem Salatsaftmedium gesammelt, dreimal mit KDS gewaschen, um E. coli zu entfernen, und dann in KDS resuspendiert. Zweihundert Mikroliter MNPs@Ab (1 mg/ml) wurden zu 800 μl Para-Lösung (Endkonzentration der Zellen: 8 × 103 bis 6,4 × 104 Zellen/ml) gegeben, um eine Endkonzentration von 200 μg/ml zu erreichen, und dann co-inkubiert mit Para für 2 Stunden bei 25 °C, um E-Para zu konstruieren. Anschließend wurden die E-Para über einen Magneten gesammelt und vor der weiteren Verarbeitung in KDS resuspendiert.

Para wurden aus dem Wachstumsmedium gesammelt und in KDS-Puffer übertragen. Dann wurden dem Para-Kulturmedium unterschiedliche Konzentrationen von MNPs@Ab zugesetzt, um Endkonzentrationen von 100, 200, 400, 800 und 1600 μg/ml für 2 Stunden zu erreichen. Die erhaltenen E-Para wurden dann 24 Stunden lang bei 25 °C inkubiert. Lebensfähige und nicht lebensfähige Zellen wurden manuell mit einem Stereomikroskop (SZMN, SUNNY OPTICAL, China) gezählt. Diejenigen Para, die unbeweglich waren und ihre typische Form nicht behielten, galten als tot. Kontrollexperimente wurden mit KDS-Puffer ohne Zusatz von MNPs@Ab durchgeführt. Die Überlebensrate (%) wurde wie folgt berechnet36:

Dabei ist N2 die Anzahl der lebenden Para oder E-Para nach 24-stündiger Inkubation und N1 die Gesamtzahl der Para oder E-Para zu Beginn des Experiments.

E-Para (8 × 103 bis 6,4 × 104 Zellen/ml) wurde mit Viruslösung (die Volumina der in dieser Studie verwendeten Systeme betrugen 1 ml, sofern nicht anders angegeben) 24 Stunden lang bei 25 °C inkubiert. Anschließend wurde das E-Para, das das Virus enthielt, durch magnetische Trennung entfernt. Das virale Genom von Viruslösungen vor und nach der Behandlung mit E-Para wurde mittels RT‒qPCR-Assay analysiert. Die für RT‒qPCR verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Der aus der E-Para-Behandlung resultierende logarithmische Reduktionswert wurde wie folgt berechnet56:

Dabei ist I0 die Konzentration des Virus vor der Behandlung (Kopien/ml) und If die Konzentration des Virus nach der Behandlung.

Einhundert Mikroliter Viruslösung wurden zu 500 μl vorbereiteter NaHCO3-Na2CO3-Pufferlösung (pH = 9,0) gegeben, gefolgt von 6 μl AF555-Farbstofflösung, gelöst in DMSO. Die erhaltene gemischte Lösung wurde in einen Dialysebeutel injiziert und 48 Stunden lang bei 4 °C in normale Kochsalzlösung gegeben.

Die Cell Tracker™ Green CMFDA-Farbstofflösung (1 μl) wurde zu 1 ml konzentrierter E-Para-Lösung gegeben. Die erhaltene gemischte Lösung wurde 30 Minuten lang bei 25 °C inkubiert. Das gefärbte E-Para und Para wurden dreimal mit KDS gewaschen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen.

Das gefärbte E-Para oder Para wurde 4 Stunden lang bei 25 °C mit dem gefärbten Virus co-inkubiert und 12 Stunden lang bei 4 °C mit Paraformaldehyd (4 %) fixiert. Die Fluoreszenzbilder wurden von CLSM (BX61, Olympus, Japan) mit der FV1000-ASW-Software (Version 4.1) gesammelt.

Die Infektiosität von EV71 in Lösung und in Para wurde durch Plaquebildungstests in RD-Zellen bewertet. Für EV71 in Lösung wurden die Viruslösungen in einer Verdünnungsreihe von 1:10 in PBS verdünnt. RD-Zellen wurden 48 Stunden lang in einer Platte mit 12 Vertiefungen ausgesät und dann wurden die Zellen 1 Stunde lang bei 37 °C mit 1 ml einer 10-fachen Virusverdünnung infiziert. Für EV71 in E-Para und Para wurde das Para-haltige Virus bei einer Konzentration von 1:10 in SDS-Lysepuffer und KDS 10 Minuten lang lysiert, um das Virus in Para freizusetzen, und die resultierende Viruslösung wurde dann 10-fach verdünnt um die RD-Zellen 1 Stunde lang bei 37 °C zu infizieren. Die viralen Überstände wurden durch DMEM ersetzt, das Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (1 %) und FBS (2 %) enthielt. Anschließend wurden die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur zur Verfestigung inkubiert und anschließend weitere 4–5 Tage bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Formaldehyd (4 %) fixiert und anschließend 15 Minuten lang mit Kristallviolettlösung (1 %) gefärbt. Abschließend wurden alle sichtbaren Plaques fotografiert und gezählt und die Endtiter entsprechend berechnet.

• Durch die Fenton-ähnliche Reaktion zwischen MNPs@Ab und H2O2 erzeugtes OH wurde mit einem EPR-Spektrometer (A300, Bruker, USA) mit der Bruker Biospin WinEPR-Software (Version 4.40.11.65) bei Raumtemperatur nachgewiesen. 5,5-Dimethyl-1-pyrrolin-N-oxid (DMPO) wurde als Spinfalle zum Nachweis von •OH verwendet. Dann wurden 100 μL DMPO (0,15 M) zu 50 μL MNPs@Ab-Lösung gegeben und unmittelbar nach der Zugabe von 50 μL H2O2 (10 M) nachgewiesen. Als Kontrollen wurden nur H2O2 und MNPs@Ab verwendet. Die Einstellungen der EPR-Messparameter waren wie folgt: 20,5 mW Mikrowellenleistung, 120 G Scanbereich und 2 G Amplitudenmodulation.

Einhundert Mikroliter TMB-Einkomponenten-Substratlösung wurden zu 900 μl KDS mit Para (8 × 103 Zellen/ml) gegeben. Die Mischung aus TMB und E-Para wurde 20 Minuten lang bei 25 °C im Dunkeln inkubiert. Die Fotos wurden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (IX73, Olympus, Japan) aufgenommen.

Einhundert Mikroliter TMB-Einkomponenten-Substratlösung wurden zu 900 μl KDS mit Para (8 × 103 Zellen/ml) oder 900 μl MNPs@Ab-Lösung (200 μg/ml) gegeben. Die Mischung aus TMB und E-Para wurde 20 Minuten lang bei 25 °C im Dunkeln inkubiert, dann wurden 100 μl SDS-Lysepuffer hinzugefügt und weitere 10 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurden 100 μl der oben gemischten Lösung in eine 96-Well-Platte gegeben und die Absorption bei 652 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (Synergy H1, BioTek, USA) mit Gen5-Software (Version 3.08) gemessen. Für jede Probe wurden drei parallele Gruppen gebildet.

Die intrazellulären H2O2-Spiegel von E-Para und Para wurden mit ROSGreen™ gemessen. Kurz gesagt, 500 μl ROSGreen™ H2O2 Probe (10 μΜ) wurden zu 500 μl KDS mit Para (8 × 103 Zellen/ml) gegeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Danach wurden die Para 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Paraformaldehyd (4 %) fixiert, dreimal mit KDS gewaschen und mit dem FITC-Kanal eines inversen Fluoreszenzmikroskops (IX73, Olympus, Japan) beobachtet.

Fünfzig Mikroliter ROSGreen™ H2O2 Probe (10 μΜ) wurden zu 50 μl KDS mit Para (8 × 103 Zellen/ml) gegeben und in einer schwarzen 96-Well-Platte mit klarem Boden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert . Für jede Probe wurden vier parallele Gruppen gebildet. Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät (Synergy H1, BioTek, USA) mit Gen5-Software (Version 3.08) bei 490 nm Anregung und 525 nm Emission gemessen und aufgezeichnet. Als Kontrolle wurde KDS verwendet. Der intrazelluläre H2O2-Spiegel wurde anhand des Fluoreszenzwerts und der Standardkurve von H2O2 berechnet (ergänzende Abbildung 20).

Die intrazellulären •OH-Spiegel von E-Para und Para wurden mittels HPF gemessen. Kurz gesagt, 500 μl einer HPF-Arbeitslösung (20 μΜ) wurden zu 500 μl KDS mit Para (8 × 103 Zellen/ml) gegeben und 45 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Danach wurden E-Para und Para 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Paraformaldehyd (4 %) fixiert und dreimal mit KDS gewaschen. Anschließend wurden E-Para und Para mit dem FITC-Kanal eines inversen Fluoreszenzmikroskops (IX73, Olympus, Japan) beobachtet.

Die Fluoreszenzintensität von HPF wurde mit ImageJ Software (Version 1.51j8, USA) gemessen.

Das E-Para-haltige Virus wurde mit einem Magneten gesammelt. Die Anzahl der durch Magnetkraft gesammelten E-Para und die Gesamtzahl der E-Para wurden manuell mit einem Stereomikroskop (SZMN, SUNNY OPTICAL, China) aufgezeichnet. Die magnetische Rückgewinnungseffizienz von E-Para wurde nach der folgenden Formel berechnet:

Dabei ist M2 die Anzahl der durch Magnetkraft gesammelten E-Para und M1 die Gesamtzahl der Para.

Die gewonnenen E-Para wurden 24 Stunden lang in einem E. coli enthaltenden Nährmedium kultiviert. Anschließend wurden diese gewonnenen E-Para weitere 2 Stunden mit MNPs@Ab (200 μg/ml) inkubiert, um VSOs zu entwickeln, und freigesetzt, um erneut 1 ml virushaltiges Wasser (~ 108 Kopien/ml) zu behandeln. Das nach der Behandlung von E-Para verbleibende Virusgenom wurde mittels RT-qPCR gemessen und der Log10-Genomreduktionswert berechnet.

Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des ungepaarten zweiseitigen Student-t-Tests oder der zweifachen Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Tukey-Mehrfachvergleichstest bewertet, wie in den Legenden der Abbildungen beschrieben. Drei unabhängige Experimente wurden wiederholt, um die repräsentativen Bilder zu erhalten (Abb. 2b, d – g, 3a, b, 4g, j, k; und ergänzende Abb. 8–10, ergänzende Abb. 13a – h, ergänzende Abb. 17a, b). , Ergänzende Abb. 19c).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Quelldaten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt. Der vollständige Bilddatensatz ist auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Shuangshuang Liu von der Core-Facility-Plattform der Zhejiang University, School of Medicine, für die technische Unterstützung bei der CLSM-Analyse. Wir danken Xiaoyan Miao von den Kerneinrichtungen des Schlüssellabors für orale biomedizinische Forschung der Zhejiang-Provinz, Medizinische Fakultät der Zhejiang-Universität, für die technische Unterstützung beim Gefriertrocknungssystem. Wir danken Siqi Wu vom Fachbereich Physik der Zhejiang-Universität für die Unterstützung bei der MPMS-Charakterisierung. Wir danken Jiaojiao Wang vom Analysis Center of Agrobiology and Environmental Sciences der Zhejiang University für die technische Unterstützung bei ICP-MS. Wir danken Xiaomin Zhang, Weilan Wang, Nianhang Rong und Xi Zheng vom Bio-Ultrastructure Analysis Lab of Analysis Center of Agrobiology and Environmental Sciences der Zhejiang University für technische Unterstützung bei der Herstellung ultradünner Schnitte und der elektronenmikroskopischen Charakterisierung. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (22037005 (RT) und 21625105 (RT)) und den Fundamental Research Funds for the Central Universities (2022ZJJH02-01 (RT)) unterstützt.

Fakultät für Chemie, Zhejiang-Universität, Hangzhou, Zhejiang, China

Huixin Li, Yihao Cui, Jiake Lin, Yuemin Zhou, Shuling Tang, Ying Zhang, Haibin Hao und Ruikang Tang

Abteilung für Kardiologie, Sir Run Run Shaw Hospital, Medizinische Fakultät, Zhejiang-Universität, Hangzhou, Zhejiang, China

Huixin Li, Ying Zhang, Haibin Hao, Zihao Nie, Xiaoyu Wang und Ruikang Tang

Qiushi Academy for Advanced Studies, Zhejiang-Universität, Hangzhou, Zhejiang, China

Huixin Li, Ying Zhang, Haibin Hao, Zihao Nie, Xiaoyu Wang und Ruikang Tang

Schlüssellabor für kardiovaskuläre Intervention und regenerative Medizin der Provinz Zhejiang, Hangzhou, Zhejiang, China

Huixin Li, Ying Zhang, Zihao Nie und Xiaoyu Wang

Labor für Virologie, Peking Schlüssellabor für Ätiologie von Viruserkrankungen bei Kindern, Capital Institute of Pediatrics, Peking, China

Yanpeng Xu

Fakultät für Chemie und Chemieingenieurwesen, Universität Nantong, Nantong, Jiangsu, China

Yang Wang

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HL, XW und RT konzipierten das Projekt und leiteten die Forschung. HL, YX, YC, JL, YZ, ST und ZN haben die Experimente entworfen, durchgeführt und die Ergebnisse analysiert. YW half bei der Materialsynthese. HL, YZ und HH beteiligten sich an der Analyse der Daten und der Interpretation der Ergebnisse. HL und XW haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Xiaoyu Wang oder Ruikang Tang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Kapil Moothi, Zhi Zhou und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Li, H., Xu, Y., Wang, Y. et al. Materialtechnisch hergestellte bioartifizielle Mikroorganismen ermöglichen das effiziente Abfangen wasserübertragener Viren. Nat Commun 14, 4658 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40397-5

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Eingegangen: 10. August 2022

Angenommen: 26. Juli 2023

Veröffentlicht: 3. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40397-5

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